高活力天冬氨酸酶的分离提纯及性质

采用基因工程技术构建具有较高活性的突变菌株 Ｔ３３， 以它为产酶菌株分离提取天冬氨酸酶， 并研究它的酶学特性． 结果表明， 分子量为 １９０ ０００． 最适反应 ｐ Ｈ＝ ８０， 最适反应温度为 ３７ ℃． 在ｐ Ｈ＝ ６０ 时， 该酶呈负协同效应； 在ｐ Ｈ＝ ８０ 时， 该酶呈正协同效应． 该酶α螺旋度为３６３％     

添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用

研究了多种添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用，考察了添加剂浓度及变性剂盐酸胍浓度对复性收率的影响．结果表明，精氨酸、乙酰胺、丙酮、硫脲及甘油均能有效促进变性溶菌酶复性，并且存在最佳的添加剂浓度使变性溶菌酶的复性收率最大．在促进复性中，乙酰胺等结构类似物与盐酸胍具有相同作用，因此，在降低复性液中盐酸胍浓度的同时，适当提高乙酰胺浓度即可获得较高的复性收率．当盐酸胍浓度为0．2mol／L时，复性收率达到90％时的乙酰胺浓度为2mol／L，但降低盐酸胍浓度至0．06mol／L时，达到相同变性收率的乙酰胺浓度需要4mol／L．甘油与盐酸胍存在着协同作用，在一定浓度的盐酸胍存在下，添加适量的甘油能获得较高的复性收率．     

葡萄糖异构酶变性与复性的有关光谱

葡萄糖异构酶(GI)是当今重要的工业酶制剂之一。本文采用GU·HCI作变性剂,Co~(2+)为保护剂,对GI的变性与复性作用的有关光谱进行了一些研究。 1材料     

天冬氨酸转氨酶及其酶学性质

从大肠杆菌中提取了天冬氨酸转氨酶,并对其酶学性质进行了系统的研究,得出该酶的最适反应温度为37 ℃、最佳反应pH范围为8.0～8.5、最佳氨基供体为L-天冬氨酸、转化反应动力学常数Km,同时对影响该酶作用的其它因素(辅酶、金属离子)作了研究.利用几种α-酮酸,考察了该酶在转化制备相应的芳香族L-氨基酸过程中的作用.为该酶的工业化应用提供了理论上的依据.     

AiiA融合蛋白包涵体变性和复性的研究

通过IPTG诱导含有pGEXaiiA-B15质粒的工程菌使其大量表达AiiA融合蛋白.由于所表达的融合蛋白多为不可溶的包涵体,须经分离、变性溶解,再经过一个合适的复性过程才能实现变性蛋白的正确折叠,得到具有生物活性的蛋白.通过含N-十二烷基肌氨酸钠的缓冲液A溶液及尿素等变性剂使包涵体溶解,磷酸盐缓冲液透析复性.SDS-PAGE电泳表明包涵体已由不可溶转化成可溶的蛋白.抑菌试验证明复性后的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌引起的马铃薯软腐病有较明显的抑制作用.     

重组人胰岛素的体外复性纯化

对大肠杆菌表达的重组人胰岛素原包涵体蛋白的变性复性条件进行了优化。考察了变性液中DTT的浓度,复性液的pH值,还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的物质的量比,甘氨酸(Gly)浓度对复性的影响。结果表明,在变性液中加入60mmol/L DTT,复性液pH9.5,GSH与GSSG物质的量比为5∶1,Gly浓度为50mmol/L条件下复性率最高。复性后的重组人胰岛素原过DEAE-Sepharose FF柱,经过TPCK-胰蛋白酶和羧肽酶B酶切后,再过Sephadex G-25柱,得到纯度较高的重组人胰岛素。目的蛋白收率为96mg/g干菌体。     

天冬氨酸酶C端缺失突变酶基因的克隆和表达

利用多聚酶链反应（PCR）技术,从天冬氨酸酶基因的3'-端删除42个碱基,缺失突变基因经克隆、转化和筛选,得到一株有C端缺失14肽的天冬氨酸酶突变体表达的转化子．突变酶纯酶活性为野生型酶的1．21倍．圆二色谱和荧光光谱的研究表明,突变酶的结构比野生型酶松散或更具柔性,天冬氨酸酶C端14肽不是其功能所必需的．     

天冬氨酸酶基因工程菌质粒pXZ70的稳定性

将pSC101质粒上的Par区域（控制质粒分配的基因座）克隆到含有天冬氨酸酶基因的质粒pXZ70上，构建成重组质粒pZZ1，将pZZ1质粒转化入大肠杆菌JM109细胞中，得到一株质粒可稳定遗传的重组子细胞，培养100代后，含质粒菌数仍在90％以上．     

番茄植酸酶分离提纯及其特性研究

运用硫铵沉淀阴离子交换柱层析,凝胶过滤、ＦＰＬＣ和活性电泳等技术,从缺磷条件下生长的番茄根抽提物中分离提纯了植酸酶。     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

双水相体系纯化天冬氨酸酶、纤维素酶和脂肪酶

用聚乙二醇(PEG)/磷酸钾双水相抽提技术分别从天冬氨酸粗酶、商品纤维素酶和脂肪酶中分离纯化出天冬氨酸酶(Aspartase)、纤维素酶(Cellulase)和脂肪酶(Lipase)。研究了PEG分子量及浓度、磷酸钾浓度、蛋白质含量、pH、氯化钠浓度等因素对分配系数,酶活回收率和分离效果等参数的影响,并设计出双水相体系抽提三种酶的相组成系统。     

XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究

常规诱导表达后收集的粗包涵体经3mol／L尿素洗涤加上表面活性剂Triton X-100作用，可将包涵体中xynⅢ的含量从37％提高到92．4％；8mol／L尿素可将包涵体完全溶解；蛋白浓度在0．2～0．25mg／mL时，pH4．550mmol／L NaOAc与pH7．520mmol／L Tris—HCl缓冲液复性效果相当；降低蛋白浓度，则是pH7．520mmol／L Tirs-HCl缓冲液复性效果相对较好；复性过程中加入DTT、EDTA、尿素、木糖等处理复性效果没有明显提高；pH7．520mmol／L Tris—HCl、0．01mg／mL蛋白浓度条件下，包涵体的复性效果最佳．     

大肠杆菌表达的成骨蛋白-1的复性研究

带有rhOP-1／pBV221-的E．coli表达得到的rhOP-1以不溶的包涵体形式存在,用高浓度的变性剂溶解后,经过DEAE-FF纯化,得到高纯度的目的蛋白。利用各种不同方法对蛋白质进行复性,并对复性结果进行比较,发现添加氧化还原剂最有助于二聚体的形成,这是由蛋白质分子的结构和理化性质决定的。     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.