LR2和TLR6在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用

[目的]建立鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体6(TLR6)在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用,为阐明鸟分枝杆菌致病机制提供依据。[方法]用鸟分枝杆菌感染U937细胞,于感染0 h、8 h、16 h、24 h和48 h后分别提取细胞总蛋白,并通过Western blot方法检测TLR2和TLR6的表达;分别提取细胞培养上清液,利用ELISA技术检测肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化情况。用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,通过Western blot方法分别检测其促凋亡因子BAX和抗凋亡因子BCL-2的表达量,用ELISA技术检测细胞培养上清液中TNF-α含量变化情况,用流式细胞仪检测U937细胞的凋亡变化。[结果]鸟分枝杆菌感染U937细胞可引起TLR2、TLR6和TNF-α表达上调;用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,可使U937细胞内促凋亡因子BAX和TNF-α表达量下降(P<0.05),抗凋亡因子BCL-2表达量升高(P<0.05),并可以明显降低感染鸟分枝杆菌后的细胞的凋亡率(P<0.05)。[结论]TLR2和TLR6与巨噬细胞凋亡相关,巨噬细胞通过TLR2和TLR6来识别鸟分枝杆菌,而鸟分枝杆菌反过来通过促进TLR2和TLR6的表达来影响巨噬细胞相关凋亡通路,从而诱导巨噬细胞凋亡。     

松萝酸对3种肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

为了探究松萝酸对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响,体外培养人白血病细胞U937、人骨肉瘤细胞MG-63、人黑色素瘤细胞A375,用不同浓度的松萝酸分别作用于3种细胞24 h和48 h,用MTT法检测3种肿瘤细胞的增殖情况. Hoechst 33342染色观察U937经松萝酸处理后细胞形态的变化,Western Blot检测U937中凋亡相关蛋白的表达情况.结果发现,松萝酸对U937、A375和MG-63细胞增殖均有抑制作用,且均呈现出时间和剂量依赖性. 3种肿瘤细胞中,松萝酸对U937增殖的抑制效果最好.通过Hoechst 33342染色发现,随着松萝酸浓度的升高,凋亡的U937细胞数逐渐增多. U937细胞经松萝酸处理后,Bax蛋白的表达量增高,Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白的表达量降低,Bax蛋白表达量与Bcl-2蛋白表达量的比值增加.由此认为,松萝酸诱导的U937细胞凋亡与Caspase依赖性线粒体途径有关.     

miR-146a在肺泡Ⅱ型上皮细胞抗结核分枝杆菌感染中的免疫调控作用

利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法分析了强毒株人型结核分枝杆菌H37Rv和减毒株卡介苗(BCG)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)株A549中微小RNA-146a (miR-146a)的表达情况;构建miR-146a腺病毒过表达载体,分析在结核分枝杆菌(Mtb)感染A549细胞中,过表达miR-146a对toll样受体(TLRs)信号通路及炎症因子的表达调控作用.结果表明, Mtb感染可引起A549细胞中miR-146a表达上调;当在A549细胞中过表达miR-146a时,在BCG感染组中TLR2的表达表现为感染后显著抑制, H37Rv感染组中TLR2表达差异不显著; TLR4在BCG和H37Rv感染组中均表现为显著下调.过表达miR-146a时,在BCG和H37Rv感染组中对TLR信号通路的下游分子髓样分化因子(MyD88)、TNF受体关联因子6 (TRAF6)、核因子κB (NF-κB)和促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6的表达均表现为感染后的抑制作用,而IL-8表达影响不明显.说明在AECⅡ细胞抗Mtb感染过程中, miR-146a负调控TLRs信号通路中MyD88、TRAF6、NF-κB和IL-6等来调控AECⅡ细胞对Mtb的感染过程.     

海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株,利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后,台盼蓝染色测定细胞存活率,稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor, MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示：对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调,但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比,突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后,细胞存活率和胞内CFU上升,吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加,分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示,embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力,但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过...     

白英总皂苷的抗炎作用及机制研究

利用脂多糖刺激RAW 264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞系)产生的炎性反应，检测了白英总皂苷对RAW264.7细胞的TNF-α、MD2和TLR4蛋白表达的影响，探讨了白英总皂苷在炎性反应中的作用及分子机制.结果表明：白英总皂苷对RAW264.7细胞无毒性作用，但对TNF-α蛋白表达有抑制作用，且这一过程可通过抑制MD2和TLR4蛋白的表达实现.     

中药喘可治注射液对小鼠腹腔巨噬细胞的影响

目的:研究中药喘可治注射液(CKZ)对小鼠腹腔巨噬细胞凋亡、一氧化氮(NO)释放和细胞因子分泌的影响,并探讨其作用机制.方法:无菌分离小鼠腹腔巨噬细胞,制备单细胞悬液,加入CKZ(终体积分数20 μL/mL)孵育4 h后, 加入过氧化氢(H2O2)、放线菌酮(CHX)、环磷酰胺(CTX)诱导细胞凋亡,荧光酶标仪结合Sytox Green染色检测细胞凋亡;加药孵育4 h后,加入细菌脂多糖(LPS,终质量浓度10 μg/mL)和IFN-γ(终质量浓度80 ng/mL),24h后Grass试剂盒检测巨噬细胞NO的量;加药孵育4 h后,加入LPS(终质量浓度10 μg/mL)和IFN-γ(终质量浓度80 ng/mL),24h后流式细胞仪结合Cytometric Bead Array(CBA)技术检测细胞因子的释放.结果:CKZ能抑制H2O2、CHX、CTX诱导的细胞凋亡;促进非刺激状态下巨噬细胞NO和IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF-α 5种细胞因子的产生, 抑制LPS和IFN-γ刺激的NO和IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF-α5种细胞因子的产生.结论:CKZ可抑制巨噬细胞凋亡,并对巨噬细胞NO的分泌和IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF-α5种细胞因子的生成具有双向调节作用.     

结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响

为研究结核分枝杆菌Hsp16．3对感染巨噬细胞凋亡的影响。分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株（H37Rv）、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16．3基因缺失突变株（△H37Rv）、卡介苗（BCG）和卡介苗Hsp16．3基因缺失突变株（△BCG）感染RAW264．7巨噬细胞株,使用流式细胞技术于感染1、3、6及12h检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其变化。结果显示,巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中在感染1、3、12h,BCG组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈O．05）;在感染1、3h,△BCG组与AH37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）;在感染3、6、12h,△H37Rv组与H37Rv组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）,△BCG组与BCG组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。由此可知,结核分枝杆菌Hspl6．3可抑制感染巨噬细胞的凋亡。     

前脑啡肽原和热休克蛋白参与宿主对结核分枝杆菌感染的应答

利用双向电泳比较了由临床分离的结核分枝杆菌感染离体巨噬细胞U937前后的全细胞蛋白组表达差异，肽指纹鉴定和生物信息学分析2个表达明显上调的斑点．确定它们分别为热休克蛋白HSP105β和前脑啡肽原．比较蛋白质组学和转录组学研究发现，热休克蛋白表达提高可能源于转录增加．提出了从神经免疫学角度研究结核分枝杆菌致病和宿主免疫机理的新思路，为解释吸毒人群中结核病高发病率提供了基础。     

油橄榄叶提取物对非酒精性脂肪肝小鼠TLR4?p38 MAPK信号通路的干预作用

探讨油橄榄叶提取物干预非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用机制。用高脂饮食9周建立小鼠NAFLD模型,造模第2周起用OLE(1 000 mg/kg)进行灌胃治疗8周,利用全自动生化分析仪测定血脂水平,放射免疫法检测炎症因子指标,定量PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝组织中Toll样受体蛋白4(TLR4)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的水平和蛋白活力。结果显示,与模型组比较,OLE干预后,血清甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)浓度显著降低;肝脏肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1β)、TLR4、p38MAPK水平和蛋白显著降低。OLE可通过调节TLR4-p38MAPK信号通路,缓解肝脏脂肪变性和炎症因子反应,抑制NAFLD的进展。     

多糖对人胃癌SGC7901细胞生长抑制

以培养的人胃癌SGC7901细胞为对象,研究了用多糖处理后培养细胞的变化特征.结果显示,多糖可以抑制人胃癌SGC7901细胞的增殖,并呈现出对剂量和时间的依赖性.用1.0×10-2g/mL的多糖处理培养细胞48h后,出现典型的形态学凋亡现象和明显的DNA片段化,细胞凋亡率达到40%左右.随着细胞凋亡的发生,BCL-2蛋白的表达下降,而BAX蛋白的表达上升.因此,结果表明多糖可以通过诱导细胞发生凋亡来抑制人胃癌SGC7901细胞的生长,从而达到治疗胃癌的目的.     

积雪草苷调控miR-342-5p/AQP3轴保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤

目的 探讨积雪草昔(Ass)对白细胞介素1B(IL-1B)诱导的软骨细胞损伤的影响及作用机制。方法 不同 浓度的Ass作用IL-1B诱导软骨细胞24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中白细 胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-342-5p和水通道蛋白3 (AQP3)mRNA表达水平,Western Blot法检测B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)和AQP3蛋 白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-342-5p与AQP3靶向关系。转染miR-342-5p抑制剂或AQP3过表达载体至软骨细胞,上述相同方法检测抑制miR-342-5p表达或AQP3过表达对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及IL- 6和TNF-α表达的影响。结果 Ass可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达及miR- 342-5p表达(P <0. 05),促进Bcl-2蛋白、AQP3 mRNA和蛋白表达(P <0.05)。miR-342-5p在软骨细胞中负调控 AQP3表达。抑制miR-342-5p或AQP3过表达后,IL-1&诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达降低 (P <0. 05) ,Bcl-2蛋白表达升高(P <0.05)。抑制AQP3表达逆转了抑制miR-342-5p对IL-1β诱导的软骨细胞凋 亡、Bax和Bcl-2蛋白及IL-6和TNF-α表达的影响。结论 Ass可抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡和炎症反应,其可 能通过调控miR-342-5p/AQP3保护软骨细胞损伤。     

不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞TfR与Lf的表达

为探讨结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株(BCG)分别感染巨噬细胞,检测细胞内转铁蛋白受体和乳铁蛋白表达量并分析其时相性变化及意义。分别采用结核分枝杆菌H37Rv株和BCG菌株感染巨噬细胞RAW264.7细胞株,于感染后1、6、12、18、24h,应用ELISA技术检测巨噬细胞上清液中TfR和Lf的表达量;应用Western blot技术于上述时间点检测巨噬细胞内TfR的表达量。结果显示,ELISA和Western blot技术均证实感染模型组检测的TfR表达量均高于正常对照组,ELISA结果显示上清液中TfR表达量在感染12和18h差异最明显,具有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示:于模型建成后1、6、18h、差异有统计学意义(P<0.05)。另外,ELISA证明感染可诱导巨噬细胞分泌较高水平的Lf,于感染后6、12、18、24h均高于正常对照组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。由此可知,结核分枝杆菌感染导致巨噬细胞内的TfR和Lf表达更高。     

紫花地丁提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞的体外抗炎作用

观察紫花地丁提取物对脂多糖诱导的RAW 264.7巨噬细胞的抗炎作用并探讨其机制.采用脂多糖(1μg/mL)诱导RAW 264.7巨噬细胞建立体外炎症模型,格里斯试剂法和酶联免疫吸附法分别检测细胞上清液中的NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度,凝胶成像法检测细胞中iNOS、COX-2蛋白水平.结果显示,紫花地丁水提物、醇提物剂量依赖地降低脂多糖刺激巨噬细胞分泌NO、TNF-α、IL-6、IL-1β以及其iNOS、COX-2蛋白水平.相同剂量(100μg/mL)的紫花地丁醇提物抗炎活性优于水提物.结果表明,紫花地丁水提物、醇提物可抑制脂多糖刺激的RAW 264.7细胞炎症,其机制可能与抑制iNOS、COX-2蛋白表达,减少NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的分泌有关.     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。     

黄芪多糖对脂多糖诱导肠上皮细胞IPEC-J2氧化应激和炎症反应的缓解作用

为探究黄芪多糖对脂多糖诱导IPEC-J2细胞炎症反应的影响.将IPEC-J2细胞分为对照组、LPS处理组、ASP处理组和ASP+LPS处理组,分别检测各组细胞活力、抗氧化指数、相关炎症因子含量和mRNA表达水平.结果表明当10 mg/L LPS作用细胞12 h后,显著降低了细胞活力.当100 mg/L ASP预处理细胞4 h后显著提高了细胞的存活率.与对照组相比,LPS组显著提高了MDA含量并降低了SOD,CAT酶活力,显著上调细胞上清液中IL-6,IL-8和TNF-α的含量以及细胞内三者基因mRNA的表达水平,显著下调了IL-10基因mRNA的表达.而采用ASP预处理4 h后可显著降低细胞内MDA含量及提高SOD和CAT酶活力,且显著下调IL-6,IL-8和TNF-α的含量和细胞内三者基因mRNA的表达及显著上调IL-10基因的表达.试验表明ASP可缓解LPS引起的氧化应激和炎症反应,抑制IL-6,IL-8和TNF-α含量及其基因表达,促进IL-10基因表达,从而发挥抗氧化和抗炎作用.     

胞二磷胆碱对大鼠脑缺血损伤后认知功能及海马神经元BCL-2,BAX表达和细胞凋亡的影响

探讨胞二磷胆碱对脑缺血损伤后大鼠认知功能和海马神经元BCL-2,BAX表达的影响.取健康Spra-gue-Dawley成年雄性大鼠60只,随机分为假手术对照组,缺血组和胞二磷胆碱组3组,每组20只.对缺血组和胞二磷胆碱组采用Zea Longa等法改良复制大脑中动脉狭窄(middle cerebral artery occlusion,MCAO)动物模型,通过Morris水迷宫系统观察各组大鼠学习记忆功能;免疫组化检测BCL-2,BAX表达,Tunel法检测神经元凋亡.胞二磷胆碱使Bcl-2蛋白表达从缺血对照组的39.88±5.41增加至55.13±8.17,BAX蛋白表达从缺血对照组的62.38±8.47下降至36.13±5.94,凋亡神经元从缺血对照组的18.67±3.86下降至14.67±4.25.胞二磷胆碱对脑缺血损伤后大鼠的神经保护作用可能是通过上调海马神经元Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白的表达,减少海马神经元凋亡进而改善脑缺血损伤后大鼠的学习记忆能力.     

太原市冬季PM2.5对人源巨噬细胞U937毒性作用的研究

多环芳烃(PAHs)是PM_2.5中主要的有机污染物和毒性成分。为了研究PM_2.5对人体细胞模型的毒性作用机制,文章收集了太原市冬季PM_2.5,首先分析了PM_2.5中16种PAHs的含量,之后使用荧光素酶法检测PM_2.5是否可以在人源HepG2细胞中激活芳香烃受体(AhR),并且将人源巨噬细胞U937暴露于溶于二甲基亚砜(DMSO)的PM_2.5有机提取溶剂6,24和48 h,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)测定细胞色素酶P450(CYP1A1),环氧化酶-2(COX-2),白介素(IL)-8、白介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达情况。结果显示:太原市冬季PM_2.5激活了AhR;与对照组相比,在3个不同暴露时间PM_2.5均诱导了CYP1A1,COX-2,IL-1β,IL-8和TNF-αmRNA的显著高表达,尤其是在暴露24 h差异极显著。以上结果表明了太原冬季PM_2.5<...     

阿糖胞苷与肿瘤坏死因子的联合应用对HL-60细胞凋亡的影响

目的观察不同浓度的肿瘤坏死因子(Tumor recrosis factor,TNF-α)、阿糖胞苷(Arabinosylcytosine,Ara-c)联合应用对HL-60细胞凋亡的影响.方法通过荧光染色观察及基因分析检测不同浓度的肿瘤坏死因子、阿糖胞苷联合应用对HL-60细胞凋亡的影响.结果浓度为1 500 U/mL的肿瘤坏死因子、阿糖胞苷联合应用比其他浓度药物应用细胞凋亡的百分率更高,Bcl-2基因表达下调.结论联合应用浓度为1 500 U/mL的肿瘤坏死因子、阿糖胞苷诱导白血病细胞凋亡效果明显.     

黄芩素的体外抗炎及抗氧化活性研究

采用LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7释放炎症介质NO、PGE2以及IL-6、TNF-α等炎症因子,以MTT法评价细胞毒性,Griess法检测NO的含量,ELISA法检测PGE2、IL-6和TNF-α水平,Western blot法检测iNOS、COX-2及内参蛋白β-actin表达水平,研究黄芩素的抗炎活性及作用机制.测定黄芩素对DPPH自由基、超氧阴离子的清除活性,评价其抗氧化活性.结果表明,黄芩素能显著抑制炎症介质NO和PGE2的产生以及炎症因子TNF-α和IL-6的释放,明显下调iNOS、COX-2蛋白表达水平,对DPPH自由基、超氧阴离子均具有较强的清除活性,且呈良好剂量依赖关系.通过对黄芩素的抗炎、抗氧化作用的研究,可以为黄芩素及相关制剂的临床应用提供一定的理论依据.