构建重组质粒的二步PCR方法

建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p ET20b一端正链序列;第二步反向PCR中,以扩增的Xyn基因作为正向引物,其3’端含有19 bp与环状p ET20b模板退火、并在高保真Q5 DNA聚合酶作用下延伸,与模板另一端互补的反向引物VR协同作用,重组质粒通过PCR扩增出来.反向PCR产物经T4 DNA连接酶环化,并经Dpn I限制性内切酶消解处理,可以直接转化BL21(DE3)感受态细胞.用这种方法将622、639、1125、1209 bp大小的基因重组p ET20b中,显示出有较广泛的普适性.     

利用RCR技术合成基因的新方法

以多条末端互补的寡核苷酸链为模板,用PCR技术能够一次扩增出目的基因片段．将预合成的350bp目的基因片段分为6条寡聚核苷酸链(S1～S6),每相邻两条寡聚核苷酸链的末端有18个碱基的互补区．先将S1S2,S3S4,S5S6分别用Taq酶延伸补平形成3条双链DNA;再将S1S2,S3S4,S5S6三条双链DNA以3：1：3的比例混合,用预先设计的含有多克隆位点的引物进行PCR扩增,一次性扩增出完整的350bp目的基因片段．     

爱玉ISSR反应体系的建立与优化

通过单因子试验和正交设计,对影响爱玉ISSR-PCR扩增效果的因素,如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs浓度、引物浓度、延伸时间和循环次数等指标进行优化.实验确立了可用于爱玉ISSR-PCR分析最适宜的反应体系：20 μL反应体积中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs;PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸2.5 min,共35个循环;72 ℃延伸7min,4 ℃保存.应用该体系对14份爱玉种质进行扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

茄子反转录转座子基因片段的克隆及序列分析

根据己报道的反转录转座子的序列设计合成一对特异引物,以西安绿茄基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法扩出一条DNA特异片段并克隆到pMD18-T载体中.用PCR法和酶切分析法对克隆片段进行鉴定并进一步进行核苷酸序列分析.序列测定该片段长为518 bp.用GenBank中的BLAST程序分析表明,该片段与马铃薯(Solanum demissum)反转录转座子的gag-pol聚合蛋白90-243aa区域氨基酸同源性为43%.     

Taq酶体外合成DNA时模板错位机制的探讨

利用Taq DNA聚合酶体外合成DNA过程中,当反应体系中缺少与模板链互补配对的dNTP底物时,产物合成并不会在底物缺失位点处终止,聚合反应继续进行.为研究此复制缺陷现象,设计一系列模板用于DNA体外酶促合成.除了已知的碱基错配机制,笔者发现存在另一种"模板错位"机制,即模板中与底物非Watson-Crick互补配对的碱基位点首先进行收缩滑动,形成模板bulge结构后再继续进行酶促合成反应.这项研究有助于提高DNA样品合成保真度以及继续深入探索体外DNA合成的详细机制.     

单链扩增复性法定向克隆蛇毒C型凝集素类蛋白基因

为克隆尖吻蝮蛇C型凝集素类蛋白基因至表达载体pBV220，在该载体的多克隆抗点上选择适当的酶切位点，设计PCR引物：在目的基因上、下游引物的5‘-端分别加上对应于载体的粘性末端序列，建立两个单独反应体系，每个反应体系中只加入一种引物，用Pfu DNA聚合酶催化模板DNA单链扩增；将所得的两种单链产物在适当条件下进行复性后直接与经过酶切的载体DNA连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得足够数量的转化子。经PCR鉴定单菌落中有目标DNA片段插入，测序表明克隆连正确，该方法以其简捷性和有效性，为基因的定向克隆提供了一个新的选择。     

藏羚羊(AAC)_n微卫星富集文库构建与引物筛选

基于磁珠富集法,利用生物素标记的寡核苷酸探针(AAC)8从藏羚羊(Tibetan antelope)基因组酶切的300~1000bp片段中筛选微卫星位点,纯化的富集片段连接到pCR@2.1载体和转化到Trans5α感受态细胞.随机挑取180个白斑克隆,PCR检测到条带数大于或等于2的阳性克隆为56个,阳性率为31.1%.对阳性克隆测序,获得43条含微卫星座位的序列,微卫星重复次数在5~20次之间.舍弃不适宜设计引物的微卫星座位,试验设计并合成了20对微卫星引物;以3个样点(青海、新疆、西藏)的24个藏羚羊基因组为模板进行PCR扩增,获得8对可得到稳定扩增产物的微卫星引物,其中4对引物的扩增产物具有多态性,座位分别为AAC050、AAC056、AAC165和AAC477.上述引物可用于藏羚羊及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等研究.     

罗汉果ISSR-PCR反应体系的建立

以罗汉果 ( Siraitia grosvenorii) DNA为材料 ,分析了模板 DNA,Mg2 + ,d NTPs,引物的浓度 ,Taq DNA聚合酶的用量以及循环次数对 ISSR-PCR扩增结果的影响 ,确立了稳定的、可重复的罗汉果 ISSR最佳反应体系和 PCR扩增参数 :在 2 5μL的 PCR反应体系中 ,含 2 0～ 5 0 ng模板 DNA,1 U Taq酶 ,1× PCR缓冲液 ,2 .0 mmol/L Mg Cl2 ,4种 d NTPs各 2 0 0 μmol/L,0 .5 μmol/L引物 ;PCR扩增程序为 94°C预变性 3 min,接着进行 40个循环 :94°C变性 1 min,5 2°C退火 5 0 s,72°C延伸 2 min,循环结束后 72°C延伸 7min.     

B病毒PCR检测方法的建立

目的建立B病毒核酸的PCR检测方法。方法设计引物,用PCR方法扩增B病毒,并验证其灵敏性和特异性。结果引物P1、P2及P3、P4在以B病毒为模板时有特定大小的目的片段出现,在以其他病毒为模板时无目的片段出现;引物P5、P6以B病毒和人单纯疱疹病毒I型(HSVI)为模板能扩增出382bp的产物,经SacⅡ酶切后,B病毒产生176bp和206bp的两个片段,HSVI无变化。结论通过PCR方法成功的区分开B病毒,并且鉴定区分了B病毒和HSVI。     

真藓(Bryum argenteum)ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了确定真藓最佳ISSR-PCR反应体系,采用PCR正交实验设计方法,对影响ISSR-PCR试验的模板DNA、引物、d NTPs、Mg2+、和Taq DNA聚合酶5个因素在4个水平上进行优化,并对100条引物逐一进行温度梯度PCR,筛选合适的引物并确定每个引物的最佳退火温度.结果显示优化的20μL ISSR-PCR反应体系中包括20 ng/20μL DNA模板、0.45μmol/L引物、2.65 mmol/L Mg~(2+)、0.4 U/20μL Taq DNA聚合酶、0.45 mmol/Ld NTPs.利用该体系最终筛选出50条扩增条带清晰,重复性好,多态性高的引物并确定其退火温度.这一体系的建立、引物的筛选及退火温度的确立为进一步利用ISSR分子标记技术对苔藓遗传多样性的研究提供理论基础.     

干用辣椒RAPD—PCR反应体系正交优化的研究

以干用辣椒幼苗为材料,研究了干用辣椒RAPD分析过程中的Taq酶、Mg^2＋,dNTPs、引物、模板DNA浓度、退火温度等影响因素,建立适合干用辣椒RAPD反应的PCR体系,即25μL反应体系中含有解体Taq酶1．5U、Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0．6mmol／L、引物0．8μmol／L、模板DNA60ng．扩增程序为：94℃预变性4min;94℃变性1min,37℃退火1min,72％延伸1．5min,40个循环;最后72℃副延伸5min．     

赤松ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立赤松ISSR-PCR反应体系,利用正交试验分别对影响赤松PCR反应的dNTP浓度、Mg~(2+)浓度、Taq酶浓度、引物浓度、模板浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度和循环次数.最终确定赤松ISSR-PCR最佳反应体系及扩增条件为:25μL反应体系中含2.5μL 10×PCR Buffer、3 mmol·L~(-1)dNTP、1.5 mmol·L~(-1)Mg~(2+)、0.5 U Taq酶、0.3μmol·L~(-1)引物、9 ng模板;扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行94℃变性30 s,55℃退火45 s(退火温度随引物不同而变化),72℃延伸2 min,35个循环,最后72℃延伸7 min.这一ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR技术对赤松进行物种分类鉴定奠定了基础.     

均匀设计优化黑木相思ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响黑木相思ISSR-PCR体系的引物、Mg2 、dNTP、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行5因素5水平和5因素3水平两轮优化,建立了适合于黑木相思ISSR-PCR的体系:在20μL反应体系中,含引物0.30μmol.L-1,Mg2 3.00 mmol.L-1,dNTP 0.15 mmol.L-1,Taq DNA聚合酶0.75U,模板DNA 2.00 ng.μL-1.在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度、退火时间进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性5 min;接着进行33个循环:94℃变性35 s,52~61.5℃退火52 s,72℃延伸90 s;循环结束后,72℃延伸10 min.同时筛选得到10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.     

半随机单引物PCR扩增产物的特异性研究

以Ｍ１３ｍｐ１９为模板,寡核苷酸“１２２４”为引物,进行半随机单引物ＰＣＲ扩增;分析其扩增产物的限制性内切酶酶切图谱,推定它们分别在Ｍ１３ｍｐ１９序列中的确切位置;证实引物“１２２４”的３端与模板Ｍ１３ｍｐ１９负链的互补结合,至少需有连续的４上个核苷酸,才能产生单引物ＰＣＲ扩增的模板分子,进行有效的ＰＣＲ扩增,并由此决定了扩增产物中各ＤＮＡ片段的大小及其在模板ＤＮＡ序列中的特定位置。     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

天花粉蛋白基因克隆、序列分析及在E.Coli中表达

天花粉蛋白为单链核糖体失活蛋白,具糖苷酶活性,对 HIV 和多种动植物病毒有明显的抑制作用,有广泛的理论价值和应用前景.本文在国内首次采用聚合酶链式反应(PCR)方法,以栝楼染色体 DNA 为模板、合成的寡聚核苷酸为引物,扩增出了编码成熟天花粉蛋白的 DNA 片段(称 gene 1)和编码含23个氨基酸组成的分泌型信号肽、成熟天花粉蛋白以及羧基端延伸因子在内的 DNA 片段(称 gene 2).两 DNA 片段已被组装于载体     

一种DNA侧翼序列分离技术--TAIL-PCR

在分子生物学研究中，基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列，热不对称交错PCR(简称TAIL—PCR)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL—PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔综述了TAIL-PCR反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。     

改进的PCR法克隆带小棒链霉菌cefD基因

以GC含量高达74％的带小棒链霉素（S．clavuligerus）染色体DNA为模板，从引物设计、退火温度、有机辅剂及DNA聚合酶等方面改善PCR反应体系和扩增条件，成功地克隆得到了异青霉素异构酶的cefD基因。改进后的PCR体系中ψDMSO＝0．05并加入适量的TaqDNA聚合酶，退火温度比常规选选择高一些，从而克服了常规PCR法扩增链霉菌基因遇到的二级结构复杂、引物与模板难以配对及引物间的引物内部易形成碱基配对等问题。改进后的PCR法提高了链霉菌基因克隆的效率，也可以广泛应用于高GC含量目的的基因的快速扩增。     

沙棘属植物RAPD-PCR反应条件的优化

采用L16(45)正交试验设计研究了沙棘属植物RAPDPCR反应中DNA模板浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2 浓度和Taq酶含量等5个因素对于PCR扩增效果的影响,并对照温度梯度探讨了退火温度等热循环参数,确定适合沙棘属植物的最佳扩增体系为:模板DNA1.0mg·L-1,引物3.0μmol·L-1,dNTPs0.1mmol·L-1,Mg2 2.5mmol·L-1,Taq聚合酶8.33～16.67nkat;扩增程序中最适退火温度为35～36℃.     

基于PCR-DGGE技术的渤海湾滩涂原油降解菌群分析

采集天津渤海湾滩涂沉积物,以原油为唯一碳源富集原油降解菌群.采用三种不同细菌DNA提取试剂盒提取原油降解菌总DNA,结果显示New Probe细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取出的细菌总DNA质量和纯度最理想.通过对PCR体系中引物量、模板量和PCR程序中退火温度、循环数的优化,确定优化的PCR条件为:25μL Master、3μL DNA模板、1μL Primer-1、1μL Primer-2、20μLdd H_2O.扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸1 min,25个循环;72℃延伸6 min.原油降解菌的DGGE指纹图谱分析表明原油降解菌群的群落结构相对稳定,没有出现明显的减弱趋势.