精氨酸修饰壳聚糖提高基因转染效率的研究

富精氨酸短肽由于其独特的内在化机理而受到了广泛的关注. 研究结果表明, 精氨酸和胍基能有效转运穿透细胞膜, 在细胞穿膜过程中扮演非常重要的角色. 本文将精氨酸接枝到壳聚糖上制备了一种新型的壳聚糖衍生物——精氨酸修饰的壳聚糖(Arg-CS), 并用复凝聚的方法制备了Arg-CS/DNA纳米复合物. 对Arg-CS及Arg-CS/DNA复合物的物理化学性质进行了表征, 并以HeLa细胞为宿主细胞研究了Arg-CS/DNA复合物的转染行为和效率. Arg-CS介导的荧光素酶质粒的表达较壳聚糖介导的荧光素酶的表达提高了大约100倍, 而MTT实验表明, Arg-CS及其与DNA复合物在整个实验浓度范围内细胞毒性均很小, Arg-CS有望成为一种高效、安全的壳聚糖基非病毒载体.     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

肿瘤基因治疗新策略—RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象. 目前介导RNAi的方法很多, 包括采用非病毒性和病毒性载体介导. 最近研究发现, 以病毒为载体介导RNAi具有显著的优越性. 病毒载体通过表达70 bp左右的发夹结构RNA (shRNA), 在Dicer酶的催化作用下, 切割成21 bp左右的双链小分子干扰RNA (siRNA), 从而有效沉默靶向基因. 运用RNAi技术可设计一系列有效的抗癌策略, 如沉默癌基因、促进调亡、调控细胞周期、抗血管生成以及提高传统化疗、放疗的疗效等. 这一技术开辟了肿瘤基因治疗的新途径. 本文就RNAi技术在肿瘤基因治疗中的应用与研究作一评述.     

microRNA对植物生长发育和病毒侵染的调控

microRNA (miRNA)是一类在真核生物中广泛存在的大小约22 nt的非编码小分子单链RNA, 它可以通过对靶标RNA的剪切或抑制靶标RNA的翻译调控靶标基因的表达. miRNA不仅参与了植物器官的形态建成, 还参与调控植物的信号转导系统等与生长发育相关的基因表达调控过程. 与植物抗病毒RNA沉默途径一样, miRNA途径也受到病毒沉默抑制子的干扰. 本文简述了miRNA介导的RNA调控途径和siRNA介导的RNA沉默路径的异同, 并对近几年miRNA在植物生长发育调控以及与病毒相互作用的研究进展进行了综述, 以求进一步理解真核生物基因表达调控的多层次性及复杂性.     

慢病毒介导的siRNA沉默MRP4基因增强急性髓系白血病对阿霉素的敏感性

化疗是急性髓系白血病的标准治疗手段,然而白血病细胞多药耐药的产生为白血病化疗的主要障碍.在耐阿霉素的K562细胞株(K562/ADR)中,MRP4表达较不耐药的K562细胞株明显增高.本研究试图运用慢病毒介导的siRNA沉默MRP4基因后研究能否增强K562/ADR对阿霉素的敏感性.首先设计并构建了5个针对MRP4基因的慢病毒介导的siRNA(lv-shRNAs-MRP4);随后用荧光显微镜观察lv-shRNA-MRP4感染K562/ADR细胞的感染效率;用real-time PCR及Western blot检测感染lv-shRNA-MRP4后K562/ADR细胞MRP4mRNA及蛋白表达;应用MTS法及流式细胞术检测感染lv-shRNAs-MRP4后K562/ADR细胞增殖活性及凋亡.荧光显微镜观察结果可见,K562/ADR细胞lv-shRNA-MRP4感染效率达到80%以上;相比较其他lv-shRNAs-MRP4,lv-shRNA1-MRP4对MRP4基因沉默效应最强;在K562/ADR细胞中lv-shRNA1-MRP4组mRNA及蛋白表达均较对照组明显受抑;联合lv-shRNA1-MRP4与阿霉素后K5...     

分选链接蛋白家族研究进展

分选链接蛋白(sorting nexins,SNXs)是一类含有吞噬细胞氧化酶同源性结构域(Phoxhomology domain,PX domain)蛋白的统称,在哺乳动物中有33个成员,其PX结构域易与定位于早期内涵体的磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate Ptd Ins(3)P)结合,参与蛋白跨膜过程中货物分子接头蛋白与膜锚定蛋白的结合等蛋白间的相互作用,故SNXs在细胞内吞、蛋白分选、细胞信号转导、膜运输、膜重塑和细胞器运动等方面均起重要作用.不同SNXs尚含差别较大的其他结构域,据差异结构域的不同,可进一步分为3大类.其中某些成员参与肿瘤、阿尔茨海默症、神经疾病和心脏病等人类重大疾病的发生.本文概述其发现、基因定位、结构、分类、功能及相关疾病等的研究现状,并展望其相关动向.     

主体分子型非病毒基因载体的基础应用

设计并制备了一种新的具有分子探针功能的主体分子型非病毒载体-邻菲啰啉-b-环糊精衍生物主体分子(DZY-1), 应用凝胶电泳法研究探讨了DZY-1与DNA相互作用及客体分子对该主体分子诱导DNA凝聚的影响; 并进一步研究探讨了单一主体分子、主/客体分子配合物诱导DNA分子凝聚和聚合所形成的超分子聚合物抗限制性内切酶(HindⅢ)酶解的特性. 应用扫描电子显微镜(SEM)观测到该主体分子、主/客体分子配合物与DNA分子相互作用形成超分子聚合物的微观结构形态. 阐述了其作为非病毒基因载体可能的传递机制, 为设计、制备新的非病毒基因载体提供了一种新途径.     

人凝血因子Ⅸ cDNA在血友病B患者骨髓基质细胞中的高效表达

1987年Anson等首次将入FIX cDNA成功地转移到中国仓鼠卵巢细胞中,并提出了基因治疗血友病B的设想.近年来,FIX cDNA已先后在皮肤成纤维细胞、成肌细胞、肝细胞、内皮细胞和角质细胞中得到不同程度的表达(表1),其中,薛京伦等进行的经皮肤成纤维细胞途径的血友病B基因治疗临床试验已取得了安全有效的结果.为进一步提高FIX的表达水平,探索新的靶细胞,我们率先以血友病B患者骨髓基质细胞(BMS)为靶细胞,将新构建的安全型反转录病毒载体LNCIX通过反转录病毒介导基因转移到BMS细胞中,基因修饰的     

传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建

通过PCR方法, 删除传染性法氏囊病毒HZ2株ORF A1和 ORF A2非重叠区的33 bp (96~129 bp)的同时, 引入NheⅠ酶切位点(GcTaGc)作为分子标记, 构建含有A节段突变体的真核表达载体pCI-Nhe3, 与HZ2株B节段真核表达载体pCI-mB在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞. 用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞, 模拟病毒“传代”. 结果表明, 细胞的形态学特征发生变化, 产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应(CPE). 电子显微镜观察显示, 在细胞超薄切片中有IBDV病毒粒子. 间接免疫荧光分析结果表明, 拯救的ANhe3株病毒的结构蛋白在CEF细胞得到了表达, 而非结构蛋白(VP5)则不能表达. 针对A节段的RT-PCR, 酶切鉴定及进一步的序列测定结果验证了相应核苷酸片段的缺失和分子标记的引入. ANhe3株病毒接种不能导致11日龄SPF鸡胚的死亡, 相对HZ2株致死率(20%)明显下降. 本研究利用基于cDNA转染和RNA聚合酶Ⅱ系统的IBDV反向遗传系统, 构建了IBDV VP5基因大片段缺失的毒株ANhe3株, 为IBDV基因组学的研究提供了新方向, 为进一步探索病毒复制和致病机制以及开发基因缺失疫苗奠定基础.     

水稻瘤矮病毒基因组第11片段编码一个RNA沉默抑制子

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)是中国及东南亚国家水稻上的一个重要病原, 但有关RGDV与植物细胞互作的分子机制仍不清楚. 本研究利用农杆菌共渗透的方法鉴定了RGDV基因组S11片段编码蛋白Pns11在转GFP (green fluorescent protein)基因本生烟纯合系(Nicotiana benthamiana line 16c)中的抑制子活性. 在该系统中, Pns11 能抑制由GFP正义RNA介导的局部和系统沉默, 并能灭活RNA沉默信号或阻断沉默信号的移动. 体外表达Pns11能增强马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)在本生烟上的致病性. 该抑制子在局部和系统沉默抑制实验中能降低siRNA 的累积, 但不能完全消除其存在. 结果表明, Pns11干扰了RNA沉默途径的起始阶段.     

Investigation on Hepatopoietin and Other Novel Genes from Human Fetal Liver

The aim of this study is to discover the molecular mechanism of the 22-week gestated human fetal liver(HFL)which rarely displays both hematopoietic and hepatic functions. Based on large-scale cDNA library sequencing and bioinformatic analysis, the largest     

PEI与Cr（Ⅲ）螯合物结构的测定及其分析应用

使用分光光度法与电导滴定法研究了聚乙烯亚胺（PED与Cr^3＋的配合过程，测定了二者形成的螯合物结构。Cr^3＋与水溶性聚胺PEI可以定量地形成六配位螯合物，而且配合过程速度很快，螯合物稳定；在用PEI水溶液滴定Cr^3＋过程中，体系的电导率快速下降，在滴定终点电导率发生了清晰的转变。建立了测定Cr^3＋含量的一种新方法-PEI螯合作用电导滴定法，考察了各种因素对分析方法的影响，优化了分析条件。     

聚合物/富勒烯太阳能电池器件最新研究进展

聚合物太阳能电池具有质量轻、柔性好、生产成本低和易于实现大面积加工等独特优势. 近年来, 以共轭聚合物作为电子给体, 富勒烯及其衍生物作为电子受体的聚合物/富勒烯太阳能电池受到了研究人员的广泛关注, 成为光伏研究领域中的热点之一. 紧扣聚合物/富勒烯光伏体系中的光吸收、激子扩散和解离以及自由载流子输运和抽取等关键科学问题, 从器件结构优化、形貌控制和界面修饰等不同侧面介绍了提高聚合物/富勒烯太阳能电池性能的方法, 讨论了相关机理, 最后对其未来的发展做出了展望.     

聚集体自噬研究进展

错误折叠蛋白在细胞内大量堆积后会形成蛋白聚集体，干扰细胞正常生理活动，以至引发各种人类疾病，尤其是神经退行性疾病。因此，研究聚集体的形成和清除过程对治疗神经退行性疾病具有重要意义。蛋白聚集体在形成过程中会受到相分离的调控，在液相、固相等多种状态间转变，这影响了聚集体的性质及其清除方式。尽管细胞内多种蛋白质量监测系统均可参与错误折叠蛋白的清除，但是一旦聚集体形成，通常需要通过自噬途径清除，即聚集体自噬过程。在聚集体自噬中，p62、NBR1、TAX1BP1、Tollip、CCT2等自噬受体能够帮助自噬系统识别蛋白聚集体，在聚集体的清除中发挥重要作用。文章主要介绍聚集体的形成以及通过自噬清除的过程，并聚焦于聚集体自噬领域的最新研究进展。     

一种新硫色满酮衍生物诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡

初步研究了新合成的(顺)-3-(氯代亚甲基)-5-甲基-硫色满-4-酮(3-chloromethylene-5-fluoro-thiochroman-4-one,CMTK)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响,分别用不同浓度的CMTK对细胞进行干预,采用改良的MTT法测定CMTK抑制细胞增殖的能力,台盼蓝染色法计数活细胞数,绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞对细胞周期的影响,同时采用流式细胞术及TUNEL染色法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labelling)检测CMTK诱导凋亡,活性检测法测定细胞中人半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8)和人半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9)的活性,ELISA法测人死亡受体3(deathreceptor3,DR3)、人肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)、人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、人半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白表达情况.结果表明,CMTK可明显抑制MCF-7细胞增殖,与顺铂(cisplatin,CDDP)相比,其抗肿瘤活性更明显,IC50为14.24±0.12molL1;生长曲线进一步说明CMTK抑制细胞增殖,其抑制作用呈时间-剂量依赖性;流式细胞仪检测分析显示,加药12和24h后可将细胞阻滞于G0/G1期(**P<0.05);TUNEL法和流式细胞仪分析CMTK可诱导凋亡的结果基本一致;与药物作用后,caspase-8和caspase-9的活性增高,并呈浓度剂量依赖性;ELISA法检测DR3蛋白量和TNF-细胞因子的量无变化,TNFR1和caspase-3的蛋白量显著增高,CMTK诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能是:不仅可以通过死亡受体TNFR1介导凋亡途径,激活caspase-8;还可以通过线粒体凋亡途径,激活caspase-9;最终激活caspase-3凋亡通路.本研究为深入研究CMTK诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供了依据.     

液体爆炸分散过程中界面破碎的实验研究

设计了一种有上下平面约束的液体爆炸分散装置, 通过阴影照相获得气液界面破碎形态变化的时间序列, 并应用平面激光诱导荧光(PLIF)得到了径向膨胀液体环内诱导的荧光照片. 采用二维图像处理、分形几何和数值模拟相结合的方法, 较系统地分析了实验结果. 最后, 讨论了液体环及其气液界面运动数学模型建立中的问题.     

加快山西省红枣加工龙头企业技术创新发展的分析

山西省是我国红枣原产地和主产区之一,以山西恒丰实业有限公司等单位为代表的红枣加工龙头企业依托红枣产业,加快技术创新步伐,将生产、加工、销售连接起来,初步形成了红枣产业化链条,推动了山西枣业经济的发展,但是也存在一些问题。文章分析了红枣加工龙头企业在技术创新发展过程中存在的一些制约因素,并提出了发展建议,以期实现经济效益与社会效益双丰收。     

中国农业经济崛起的必由之路

文章主要讨论以食品为主的农产品加工业,通过对目前我国农产品加工业发展现状进行分析,以及对发展农产品加工业的战略背景和可行性深入研究,提出相应的发展战略,以期对加快我国农产品加工业的的发展,提高竞争力,对农业经济的崛起做好带头作用。     

福辛普利钠预处理对缺血后适应大鼠心肌组织Toll样受体表达及炎症因子的影响

大鼠预先灌胃福辛普利钠, 观察其和缺血后适应(ischemic postconditioning, IPoC)对大鼠心肌缺血再灌注(ischemic reperfusion, I/R)损伤后心肌组织Toll样受体(toll-like receptor, TLR)表达及心肌组织炎症浸润的影响. 将60只SD (Spragu-Dawley)大鼠随机分为假手术组、I/R组、IPoC组以及福辛普利钠+IPoC组, 每组15只. 假手术组大鼠心脏前降支下置线不结扎; I/R组予以心脏前降支结扎30 min, 再灌注1 h; IPoC组给予心脏前降支结扎30 min, 后予以3次10 s的再灌注/缺血循环, 再持续灌注1 h; 福辛普利钠+IPoC组则预先给予福辛普利钠片0.9 mg/kg, 连续灌胃14 d, 于末次灌胃2 h后, 施以IPoC组的干预过程. 所有实验大鼠腹主动脉取血并分离出心脏组织. 比色法测定血清肌钙蛋白T (cardiac troponin T, cTNT)的含量, NBT染色测定大鼠左室心肌梗死面积, 酶联免疫吸附测定法测定心肌组织单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平. 免疫组织化学方法测定心肌组织TLR2及TLR4的表达, HE染色观察心肌组织炎性细胞的浸润. 结果表明, 与I/R组比较, IPoC组大鼠心肌梗死面积明显缩小(P<0.01), 大鼠血清cTNT水平显著降低(P<0.01), 心肌组织MCP-1, TNF-α含量和炎性细胞浸润数量明显下降(P<0.05, P<0.01), 心肌组织TLR2及TLR4的表达被显著抑制(P<0.01); 与IPoC组比较, 福辛普利钠预处理可进一步降低IPoC大鼠心肌梗死面积(P<0.05), 心肌组织TNF-?水平也显著降低(P<0.01), 对心肌TLR2及TLR4的表达有进一步抑制(P<0.05). 血管紧张素转化酶抑制剂福辛普利钠预处理可加强IPoC对I/R大鼠心肌的保护作用, 其机理可能与抑制TLR介导的炎症信号通路和趋化因子反应有关.