重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价

人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。     

表达Kallistatin的9型重组腺相关病毒的制备及其体外表达效率

采用三质粒磷酸钙共转染生产系统,制备出可以表达内源性抗肿瘤血管生成因子(Kallistatin)的9型重组腺相关病毒(rAAV2/9)和2型重组腺相关病毒(rAAV2/2).rAAV经银染法鉴定其纯度;采用WesternBlotting法比较rAAV2/9和rAAV2/2外壳蛋白的大小;qPCR方法检测rAAV的滴度.使用rAAV2/9-Kal-listatin和rAAV2/2-Kallistatin分别感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)后,RT-PCR和ELISA法分别检测Kallistatin的mRNA和蛋白表达水平.结果表明:纯化的病毒纯度达到98%以上;rAAV9外壳蛋白比rAAV2的大.感染HUVEC后,rAAV2/9介导Kallistatin在mRNA和蛋白表达水平都要比rAAV2/2高.     

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的:用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用.方法:设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794～1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上, 构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达.用SDS-PAGE 和Western blotting 分析表达产物.结果:成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白.重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达.结论:重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合.     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建与表达

人心肌肌钙蛋白Ⅰ(hcTnI)是临床检测心肌损伤及预后提供诊断的生物学指标,由于来源有限,采用基因重组技术,以期获得高表达量的人心肌肌钙蛋白Ⅰ.人工合成hcTnI基因,将其插入pET-11a载体中,通过酶切鉴定正确后转入表达宿主菌BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白.采用蛋白免疫印迹反应(Western Blot,WB)鉴定表达目的蛋白的免疫特异性.经SDS-PAGE证实重组蛋白的相对分子质量约为2.6×104,凝胶密度扫描软件检测到目的蛋白占总蛋白比例为30.1%,WB实验验证诱导后目的蛋白特异性良好.成功构建了重组hcTnI基因在大肠杆菌表达的工程菌株,并获得表达,为制备高特异性的抗体及临床检测应用和测定标准化奠定了基础.     

重组人血管内皮细胞生长因子的表达及活性研究

目的 :用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子 (VEGF) ,分离纯化并检测其生物学活性 ,以研究其在药学领域潜在的药用价值。方法 :利用PCR技术扩增VEGF基因片段 ,克隆到pQE30表达载体中 ,转化E .coliM15菌株后用IPTG进行诱导表达。经裂解细胞、变性、复性和Ni-NTAagarose金属螯合柱层析等方法纯化得到VEGF。用鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管生成实验检测VEGF的生物活性。结果 :重组表达质粒在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为 2 0 6 0 0的融合蛋白 ,它以不溶性的包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白的 30 %左右。经分离纯化融合蛋白SDS -PAGE显示为单一区带。CAM结果表明给药组血管生成数 (2 1 7± 3 1、39 3± 2 8)与对照组 (15 4± 1 9、2 9 2± 4 2 )相比有明显增加 (P <0 0 5 )。结论 :利用原核表达系统得到血管内皮生长因子具有天然VEGF生物学活性 ,为进一步的应用研究奠定了基础。     

D型产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达与纯化

复苏实验室保存的产气荚膜梭菌ε-pET28a(DE3)菌株,经限制性内切酶EcoRⅠ,XhoⅠ双酶切鉴定后,诱导表达得到大量可溶性的ε重组毒素蛋白.对重组蛋白进行镍柱纯化,得到纯度高于95%的毒素蛋白,利用Western Blot和ELISA分析检测纯化后的毒素蛋白,显示该蛋白具有良好的特异性和免疫原性,为进一步研究单链抗体做铺垫.     

重组人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体的制备

为制备人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体,制备并纯化了VEGF蛋白,通过免疫、细胞融合、筛选等方法获得了能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株;采用小鼠腹腔接种法制备腹水,并用G蛋白(Protein G)亲和层析柱对抗体进行了纯化;采用间接ELISA及Western blot实验分别对纯化后的抗体进行了效价测定和特异性验证.结果表明:此方法可成功筛选出能稳定分泌VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化后腹水抗体效价为1∶1 024;Western blot检验证实制备的单克隆抗体能特异性识别VEGF蛋白.     

卵形鲳鲹Hepcidin-5的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了制备高效的卵形鲳鲹hepcidin-5蛋白多克隆抗体和对其特异性进行鉴定,本研究通过PCR扩增的方法获得了卵形鲳鲹抗菌肽hepcidin-5(Tro H5)的成熟肽cDNA序列,并构建了原核表达载体pET-32a(+)/TroH5,然后将其转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行原核表达.经IPTG诱导,成功表达了相对分子质量约为35kDa的融合重组蛋白.经不同诱导条件的优化,最终确定在IPTG终浓度为0. 1mmol/L和温度为20℃时,其表达量最大.可溶性分析表明:该融合蛋白主要存在于上清中.经镍柱亲和层析纯化获得了纯度较高的融合蛋白,然后以免疫小鼠制备多克隆抗体,经ELISA法检测,其效价达到1∶105.蛋白免疫印迹(Western blot)检测表明:所制备的多克隆抗体特异性强.本研究为进一步探究hepcidin-5的生物学功能奠定了基础.     

小凹蛋白-1和钙受体在人的脐静脉内皮细胞的表达

为探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达及定位,为进一步功能研究提供理论依据,采用Western-blot和Rt-PCR及免疫荧光技术检测HUVEC中小凹蛋白-1与细胞外钙受体mRNA和蛋白表达及定位.结果显示:(1)形态学观察和免疫细胞化学法测Ⅷ因子抗原,95%以上的细胞呈阳性着色,证实细胞为HUVEC.(2)RT-PCR检测到HUVEC中459bp和260bpmRNA表达,Western-blot测到HUVEC中22KD和150-160KD蛋白表达.(3)免疫荧光检测到小凹蛋白-1与细胞外钙受体定位于人脐静脉内皮细胞膜.由此可知,人的HUVEC中有小凹蛋白-1与细胞外钙受体表达,两者是否共定位及其功能有待进一步研究.     

GGPPS多克隆抗体的制备与鉴定

构建人香叶基香叶基二磷酸合成酶基因(GGPPS)原核表达载体,制备兔抗人GGPPS多克隆抗体.利用DNA重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-GGPPS,诱导表达GGPPS融合蛋白,分离纯化该融合蛋白后,作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.成功构建了pGEX-4T-1-GGPPS原核表达载体,转化Rosetta菌株后可高效表达GGPPS融合蛋白,成功制备GGPPS多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价为1∶32000,并且抗体具有良好特异性.成功克隆GGPPS基因并制备了特异性的兔抗人GGPPS多克隆抗体,为进一步研究GGPPS的功能奠定了基础.     

F165发动机曲轴箱的强度分析

先运用有限单元法建立起F165发动机曲轴箱的力学模型,并对其应力分布进行了计算和分析然后根据分析的结果,对原始的模型做了局部修改最后通过理论计算和测试两种手段验证了改动的合理性,使得曲轴箱的应力分布状况有了明显的改善,从而提高了它的工作性能和寿命     

耐低温木霉TR-165固态发酵条件的研究

目的 为使木霉代替农药，对土壤中分离筛选的低温木霉TR-165固态发酵条件进行研究。方法采用单因素实验。结果在含麸皮、苹果渣及无机盐的固料中，于pH7．0，含水量20％，接种量8％(孢子液／固料)，初始2d为24℃，第3—5d为20℃，第6d为26℃，固料厚度2cm，每4-5h搅拌并喷水1次，发酵7—9d，孢子密度可达10^10mg^-1以上。结论以麸皮、苹果渣及无机盐为固料发酵生产低温木霉是一种快速、高效和实用的方法。     

反义VEGF165基因对肝癌细胞生长的抑制作用

人肝癌细胞株SMMC-7721体外转染反义VEGR_(165)基因,观察反义VEGF_(165)基因对肝癌细胞生长的作用。用分子克隆的方法构建反义VEGF_(165)基因其核表达载体 pcDNA_3-as-VEGF_(165),用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将反义基因转入SMMG-7721肝癌细胞株,观察反义VEGF_(165)基因抑制肝癌细胞 VEGF蛋白表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡的作用。RT-PCR结果显示转染反义VEGF_(165)基因后肝癌细胞内 VEG mRNA水平显著下降;ELISA方法显示转染反义基因 2 d后培养液上清 VEGF蛋白分泌显著下降((142.01±7.95)vs(1 625.52±64.46)pg/mL,n=4,P<0.01);免疫组织化学染色显示在培养板中转染及义VEGF_(165)基因的肝癌细胞细胞数显著减少,仅有少数细胞表达VEGF蛋白。流式细胞仪结果显示转染反义VEGF_(165)基因2 d后肝癌细胞的存活率下降了 12.53％(n=4,P<0.05),而凋亡率则上升了 13.12％(n=4,P<0.01)。MTT法显示反义VEGF_(165)基因能显著抑制肝癌细胞的增殖。反义VEGF_(165)基因能显著的抑制肝癌细胞VEGF蛋白的表达,抑制细胞的增殖,促进肝癌细胞凋亡。因此反义VEGF_(165)基因治疗有望成为一种新的治疗肝癌的方法。     

T轻巧化165F柴油机的设计思想与结构技术特点(英文)

介绍了轻型 1 65F柴油机的主要设计思想、技术参数、结构与技术特点 ,性能指标及其应用范围。     

MCu功能性IUD与活性165IUD的12个月临床效果观察

本文对2004年1月～2004年6月在吉安市计划生育服务站放置MCu功能性IUD,活性165IUD各200例育龄妇女,置器后定期随访(1、3、6、12个月)累计12个月资料统计显示脱落率MCuIUD为1%,活性165IUD为6%;妊娠率MCuIUD为0.5%,活性165IUD为3%;续用率MCuIUD为97%,活性165IUD为85%.结果提示MCuIUD避孕效果明显,脱落率低、副反应少、续用率高的特点.     

MCu功能性IUD与活性165IUD的12个月临床效果观察

本文对2004年1月～2004年6月在吉安市计划生育服务站放置MCu功能性IUD,活性165IUD各200例育龄妇女,置器后定期随访(1、3、6、12个月)累计12个月资料统计显示:脱落率:MCuIUD为1%,活性165IUD为6%;妊娠率:MCuIUD为0.5%,活性165IUD为3%;续用率:MCuIUD为97%,活性165IUD为85%.结果提示:MCuIUD避孕效果明显,脱落率低、副反应少、续用率高的特点.     

165例腹外疝无张力修补术的临床统计分析

为了探讨腹外疝无张力修补术的临床疗效、运用价值,对比分析了165例无张力修补术的临床资料及其主要术式的应用情况.结果显示：165例腹外疝患者行无张力疝修补术后随访6～48个月均无复发;102例/侧Lichtenstein手术5、9例/侧Rutkow手术和12例/侧IPOM手术在住院天数、并发症发生率、复发率等方面的统计...     

VEGF165过表达对小鼠乳腺癌及肿瘤周边皮肤血管生成模式的影响研究

已证实乳腺癌细胞表达有VEGF165的第3个受体NRP1,但目前在乳腺癌细胞中过表达VEGF165对肿瘤周围血管生成模式的影响尚未有人研究.通过脂质体转染的方法得到稳定转染过表达VEGF165的细胞克隆,皮内接种研究其对周围皮肤生血管模式的影响.结果显示VEGF165在乳腺癌中过表达可使肿瘤周围皮肤产生树状血管生成模式,且会诱导不成熟的血管生成并致出血.稳定过表达VEGF165的乳腺癌克隆的建立,为进一步研究过表达VEGF165对乳腺癌的影响奠定了基础.     

Construction of plant seed-specific expression vectors pSCB and pSCAB and the obtainment of transgenicBrassica napus H165 expressing poly-3-hydroxybutyrate synthetic genes

The seed-specific promoter and transit peptide were amplified and fused to the three genesphbA, phbB andphbC encoding PHB synthetic enzymes, respectively. Seed-specific expression vectors pSCB containingphbC andphbB, and pSCAB containingphbC, phbB andphbA, were constructed by introducing the genes with promoter and peptide into the binary vector pBI101. TransgenicBrassica napus H165 were obtained byAgrobacterium-mediated transformation with these vectors. They were confirmed by PCR, Southern and RT-PCR analyses.