松材线虫和拟松材线虫种间及种内遗传相关性的RAPD分析

运用RAPD技术对来自日本、韩国、美国、加拿大和中国大陆6省及台湾地区的松材线虫和拟松材线虫16个虫株的基因组DNA进行随机扩增,聚类分析结果显示,松材线虫和拟松材线虫明显分为两大类。在松材线虫群体中,又可分为3个亚组:中国大陆虫株与日本虫株为一亚组,加拿大虫株为一亚组,中国台湾虫株与美国虫株为一亚组。拟松材线虫群体亦可分为两亚组:一为日本、中国台湾和中国江苏虫株,二为韩国和中国湖南虫株。     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

松材线虫与拟松材线虫RAPD检测技术

采用RAPD技术对松材线虫和拟松材线虫进行了检测研究,从140个随机引物中筛选出引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18。引物OPK09对12个松材线虫株系扩增出一条约2400bp左右的特异片段,引物组合OPC18 OPN18对10个拟松材线虫株系扩增出一条970bp左右的特异片段。实验表明,引物OPK09与引物组合OPC18 OPN18具有特异性强、灵敏度高的优点。用这两组引物可以快速、准确鉴定松材线虫和拟松材线虫。     

松材线虫和拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究

目前松材线虫的致病机理尚不明确,其食道腺可能在致病过程中起重要作用。文章介绍了松材线虫的寄生方式及其致病机理,并对松材线虫与拟松材线虫食道腺及分泌颗粒超微结构的比较研究进行了文献的整理和分析。     

黑松与松材线虫和拟松材线虫互作早期超氧自由基研究

为探讨黑松受不同毒力松材线虫与无毒拟松材线虫侵染后,超氧自由基(O2.-)在互作早期对松材线虫病发生发展的作用,采用2年生黑松接种强毒、弱毒松材线虫与无毒拟松材线虫,于接种后4、12、24、48、72、96、120 h对受侵染黑松的茎干和针叶取样测定。结果表明:黑松受不同毒力供试线虫侵染后体内O2.-和SOD活性变化差异显著。接种后12 h,松树茎、叶中的O2.-均出现第1次突增,茎部突增的强度与供试线虫毒力呈负相关,在针叶内O2.-出现第2次突增,且无毒拟松材线虫处理(48 h)的启动时间早于强毒松材线虫(72 h)的。SOD活性在接种无毒拟松材线虫的松树茎、叶中出现两次突增,而接种强毒松材线虫的处理仅出现1次突增。3种处理黑松茎、叶的Mn-SOD含量在24 h后第1次突增,且接种无毒拟松材线虫的高于接种强毒松材线虫的。O2.-与SOD的变化趋势在一定程度上呈正相关关系,但SOD的特异变化滞后于O2.-的变化。由此可见,超氧自由基可能是松树受松材线虫侵染后进行信号转导的重要桥梁物质。     

拟松材线虫个体发育研究

【目的】探索拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)的繁殖能力,并对其胚胎发育过程中经历的重要阶段和卵的形态变化进行研究,了解胚胎发育和完成整个生活史所需时间,为进一步研究其生长发育并进行有效防控提供参考。【方法】分别挑取3组180条拟松材线虫雌成虫,观察记录雌虫在25 ℃条件下的产卵情况,每隔2 h统计每组线虫的累积产卵量,直至卵的数量基本不再增加。挑取尚未产卵的拟松材线虫雌虫于载玻片上,待其产卵后,将卵置于蔡司体视显微镜下观察。连续观察胚胎的发育过程并使用照片记录不同发育阶段胚胎的形态变化,记录卵发育至不同阶段所需时间。挑取约200个刚产下的拟松材线虫卵,在25 ℃条件下发育24 h后每隔4 h统计其总孵化率,直至孵化数不再增加,设置3组重复。将刚孵化的2龄幼虫接种于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)上,分为3组,每组设置3个重复,分别在接种1、2、3 d后使用贝尔曼漏斗法收集线虫,计算混合龄线虫中每龄期线虫所占比例,计算拟松材线虫胚后发育及完成整个生活史所需时间。【结果】① 在拟松材线虫产卵能力方面,0~10 h拟松材线虫产卵总量增长较快,16 h后产卵量逐渐趋于稳定,28 h内雌虫平均累积产卵12粒/条。② 拟松材线虫的胚胎发育过程主要经历以下几个关键阶段:单胞期、双胞期、3胞期、4胞期、5胞期、8胞期、16胞期、囊胚期、利马豆期、蝌蚪期、蠕虫期、1龄幼虫(J1),至孵化为2龄幼虫(J2)时结束。③ 在胚胎发育前期,第1次卵裂发生的位置存在两种情况,即卵的1/2和1/3处。双胞发育至5胞时也存在两种不同的发育方式,一种是双胞不移动直接分裂成3胞并列排列,另外一种是细胞进行移动,3胞呈三角形排列。通过观察30个卵的第1次卵裂和100个卵双胞的发育过程发现,这些不同的发育方式均是普遍存在的。④ 在25 ℃条件下,拟松材线虫卵的累积孵化率随时间增加而增加,在32 h时达到最高(93.31%),随后逐渐趋于稳定。⑤ 在25 ℃条件下记录了拟松材线虫卵从单胞发育至各个阶段的时间,完成整个胚胎发育过程需要约28 h。2龄幼虫接种于灰葡萄孢3 d后即可获得新的2龄幼虫,因此拟松材线虫完成整个生活史只需要3 d。【结论】对拟松材线虫卵从单胞阶段直至孵化的整个胚胎发育过程进行观察发现,拟松材线虫完成胚胎发育大约需要28 h,完成整个生活史需要3 d。对拟松材线虫产卵能力和卵的孵化率进行统计,收集拟松材线虫卵和2龄幼虫的最佳时间分别为16 h和36 h。拟松材线虫胚胎发育前期,在第1次卵裂期以及由双胞期发育至5胞期的两个过程中均存在两种与同属线虫不同的发育方式。这种现象还有待进一步研究。     

俄罗斯拟松材线虫的致病性

调查表明在俄罗斯目前尚未发现松材线虫的分布,但是有松材线虫的近缘种拟松材线虫的分布。在温室中利用从俄罗斯远东地区天然病死树上分离到拟松材线虫BmRFE,其分离物的接种实验表明,BmRFE分离物可使5年生Pinus koraiensis和Larix olgensis全部死亡,而70 %的P.sylvestris和P.densiflora可存活下来。室外试验的结果表明,用3种拟松材线虫分离物接种黑松,1 a之后只有BmRFE接种的2年生黑松中的线虫存活下来。在第2次试验的南方利用B.mucronatus(BmKOMY)和法国拟松材线虫分离物(BmFr),及两者杂交种分离物接种4年生P.sylvestris,结果表明接种后1 a几乎所有分离物均存活下来了,但是只有接种BmFr的松树表现出病害症状。病状的严重程度与拟松材线虫携带的致病细菌的毒性有关。毒性生测证明拟松材线虫BmRFE分离物携带了致病性最强的细菌。     

松材线虫和拟松材线虫活体染色比较其分泌-排泄物

松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松属树种上的一种毁灭性的病害,因此,对松材线虫致病机理的研究具有重要的理论和实践意义.根据松材线虫和拟松材线虫致病性的差异,通过活体染色对松材线虫和拟松材线虫分泌-排泄物进行了比较研究,发现松材线虫和拟松材线虫线虫分泌-排泄物存在明显的差别,这种差别可能与松材线虫的致病性有关.     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90基因结构特征及其分子进化

转录组的多态性是探讨物种多样性与分子进化的重要方面。笔者选取物种间保守性较高的HSP70、HSP90蛋白作为研究对象,探讨二者在松材线虫和拟松材线虫基因组中的结构差异,探明他们在松材线虫和拟松材线虫中的特点,并试图揭示两种线虫的系统发育关系。结果表明二者内含子具有丰富的多态性,内含子中的G+C含量也显著不同。核酸序列gABG和gmc2分别编码松材线虫和拟松材线虫HSP70的642个氨基酸,相似性高达99%,仅存在9个氨基酸的差异,并且这种差异是由13个碱基的多态性造成的。gABO和gmc19分别编码松材线虫和拟松材线虫的HSP90,其氨基酸序列相似性为92%。对同义密码子的偏好性分析表明,17种氨基酸对应的58个密码子中,gABG和gmc2存在10个密码子差异,gABO和gmc19存在5个密码子差异。采用邻接法分别构建的系统进化树表明松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90在系统发育关系上最为接近,并与其他线性动物门物种高度同源。     

不同致病力线虫侵染后黑松的水势和根系活力的变化

分别用强、弱致病力松材线虫虫株和无致病力拟松材线虫虫株接种2年生黑松,观测接种后不同时间段黑松茎段水势和根系活力变化情况。结果表明：接种强、弱致病性松材线虫虫株后,在未表现出明显症状时,黑松水势都有一个降低然后回升的过程,但当树体内线虫开始大量繁殖、外部表现萎蔫症状时,黑松水势发生不可逆转的急速降低,松树死亡,强致病性松材线虫虫株比弱致病性松材线虫虫株导致黑松茎水势丧失速度快。接种无致病力拟松材线虫后,开始黑松水势下降,然后缓慢回升接近正常水势,随着线虫的死亡,树体水势恢复正常。接种3种线虫虫株后,黑松根系活力随着线虫的侵入都有一个升高的过程,接种强、弱致病力松材线虫虫株后,黑松出现萎蔫时,根系活力虽然有所下降,但仍然保持较好的根系活力,直到松树干枯后根系活力才丧失,这与干旱胁迫下,植物首先丧失根系活力然后表现萎蔫不同;接种无致病力拟松材线虫后,随着拟松材线虫在黑松体内的死亡,黑松的根系活力在升高后逐渐恢复正常。     

松材线虫快速检测试剂盒研制

采用引物对K09F2/R对枯死松树内分离的松材线虫、拟松材线虫及其他线虫进行检测,结果表明,所有松材线虫株系均扩增出一条340 bp的清晰、明亮的条带.而拟松材线虫、其他线虫均无扩增产物.利用引物对K09F2/R构建了松材线虫检测试剂盒.采用该试剂盒可使整个检测过程不超过2.5 h;该试剂盒检测灵敏度为1/7 条线虫,达到了对幼虫成功鉴定的目的,且检测结果便于判读,检测费用较低.     

松材线虫与其携带细菌之间的相互影响

笔者研究了从松材线虫体上分离的2 株强致病菌和1 株弱致病菌与松材线虫的相互影响。结果表明:强致病菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZpB1 2A菌株能够明显地促进无菌松材线虫的产卵量增加、繁殖速度加快和成虫虫体生长;同时,松材线虫也能促进强致病菌荧光假单胞菌GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌ZpB1 2A菌株的繁殖。而泛菌(Pantoea sp.)ZM2C菌株完全抑制了无菌松材线虫的繁殖,无菌松材线虫对泛菌ZM2C菌株的繁殖亦具有显著抑制作用。由此说明松材线虫与其携带的某些致病菌之间存在互惠共生现象,松材线虫携带的致病菌并不是偶然的污染,它们之间的互惠共生现象是在长期共生进化中形成的。笔者还讨论了互惠共生现象在松材线虫致病过程中的作用。     

湖北恩施松材线虫病的防治现状及对策

湖北恩施市自1999年城区及周围发现松材线虫病以来，累计发病面积已达600多hm^2。从2000年春起，经过2年除治，取得较好的结果，但也存在一定的问题。本文对恩施松材线虫病的分布情况。防治现状及存在问题进行了阐述和分析，并提出了下一步应采取的对策。