Clostridium butyricum蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其功能研究

本研究克隆表达丁酸梭菌Clostridium butyricum DSM10702菌株的蔗糖磷酸化酶基因,并探究重组酶的酶学性质和转糖苷功能。从丁酸梭菌C.butyricum DSM10702菌株中克隆蔗糖磷酸化酶基因cbsp,构建重组表达质粒pQE30-cbsp并在大肠杆菌Escherichia coli XL1-blue中诱导表达;将重组蛋白经镍柱纯化后,进行酶学性质和转糖苷功能研究。实验结果表明,以蔗糖为底物,重组酶Cbsp的最适温度为45℃、最适pH为7.0、V_max和K_m分别为(957±23.29)μmol·mg^-1·min^-1和(62.4±4.749) mmol·L^-1。当以葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)为糖基供体时,重组酶Cbsp对于多数单糖、糖醇类、(-)-儿茶素、己基-β-D-吡喃葡萄糖苷和L-抗坏血酸表现出转糖苷活性。以上研究结果可丰富蔗糖磷酸化酶相关数据库,为其应用研究提供参考。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的克隆与表达

利用分子生物学方法对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因进行克隆与表达.培养菌体后提取总DNA,用PCR法扩增其亚油酸异构酶基因,再将其克隆到pET30a载体上,转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,并用Ni2 金属鳌合层析对重组蛋白进行分离和纯化.通过实验,得到了亚油酸异构酶的基因,成功转入到载体中,表达出了可溶性的重组蛋白,并对其进行了纯化.实验表明,在原核细胞中可以表达出可溶性重组亚油酸异构酶,以200 mmol/L的咪唑洗脱液进行洗脱可以获得目标蛋白.     

不同来源重组漆酶的酶学特性

以来源于变色栓菌的同工酶LacA、LacB、LacC,杂色云芝的同工酶Lcc1、Lcc2,以及细菌ARA等6种重组漆酶为研究对象,比较了它们的最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性、pH稳定性、动力学常数K_m,以及Cu²⁺对漆酶酶活的影响等酶学特性。结果表明:以邻联甲苯胺为底物时,LacA、LacB、LacC、Lcc1、Lcc2、ARA的最适反应温度分别为60、60、70、60、55和75 ℃; 以愈创木酚为底物时,6种漆酶的最适反应pH分别为5.0、5.0、4.5、5.0、4.5、7.0。LacA在催化ABTS、愈创木酚、邻联甲苯胺、丁香醛连氮以及2,6-二甲基苯酚时,其最适反应温度分别为55、70、60、20、65 ℃。此外,真菌漆酶在30～60 ℃,pH为2.5～7.0范围内都有较好的稳定性,细菌来源的漆酶在80 ℃下保持60 min,在pH=7.0时保持6 h仍具有较高的酶活力。Cu²⁺对细菌漆酶的激活作用要明显高于真菌漆酶。同时,以ABTS为底物时,K_m值最小,且不同来源漆酶的K_m值相差不大。因此,6种不同来源的重组漆酶在催化同一种底物时,酶学特性存在着差异性,同一种重组漆酶在催化不同底物时,其酶学特性也有较大差异。     

D-甘露糖异构酶在大肠杆菌中的表达及催化条件的研究

根据已知的放射性土壤杆菌体内的D-甘露糖异构酶（Fmi）氨基酸序列,设计适合在大肠杆菌内表达的Fmi基因序列（1245bp）,采用体外基因拼接合成。构建了表达Fmi的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET30-Fmi,诱导表达的Fmi蛋白经SDS-PAGE验证为可溶性蛋白,分子量44000。通过实验优化了Fmi的催化条件,结果表明Fmi催化的最适pH值为7.5,最适温度为45℃,催化1h酶活达5.29U/mL。以25%的果糖溶液为底物时,催化2h果糖转化率达29.4%。     

亚油酸异构酶高产菌株的选育及产酶条件的优化

共轭亚油酸是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸.以嗜酸乳杆菌为出发菌株,经紫外诱变选育,获得1株共轭亚油酸高产菌株并对其发酵条件进行优化.紫外照射选择30 s为适宜的照射处理时间,诱变菌株酶活比原始菌株提高了1.51倍.对培养基的产酶条件进行优化,结果酶活是未优化前的1.1倍.     

枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶的纯化及其酶学性质

利用硫酸铵盐析缓冲液透析、聚乙二醇浓缩、DEAE-Sepharose FF窝子交换层析等方法,纯化了枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶,并研究了其酶学性质。结果表明:纯化的枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶的分子质量约为40 ku,酶的纯化倍数为14.1倍; 最适反应pH和pH稳定范围分别为5.6和5.0～7.0; 最适反应温度和温度稳定范围分别为55 ℃和40～70 ℃; Ca²⁺对该酶的促进作用最为明显,Li⁺的抑制作用最明显。     

嗜酸乳杆菌表面疏水性对其亚油酸异构酶酶活的影响

研究碳源、氮源、生长时间以及生长温度对嗜酸乳杆菌细胞表面疏水性及其亚油酸异构酶酶活力的影响.通过Minitab15软件进行嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶酶活力对其表面疏水性的回归分析,结果表明,嗜酸乳杆菌菌体表面疏水性与其亚油酸异构酶酶活成正相关关系,回归方程为:y=1.5500x+78.163.R2=0.7507说明模型有较高的拟合度,显著性分析P(0.003)P(0.05),结果显著,可作为响应预测.     

Klebsiella sp.GXK-1的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

【目的】克隆、表达克雷伯氏菌Klebsiellasp.GXK-1菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,并研究重组酶的酶学性质。【方法】比对分析GenBank数据库中克雷伯氏菌同属的α-L-鼠李糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因的保守区。扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-rha1,并在大肠杆菌E.coli XL-blue进行诱导表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究目的蛋白RHA1的酶学性质。【结果】以pNPR为底物,进行重组酶酶学性质的研究。重组酶RHA1的最适pH值和最适温度分别为5.0和45℃,Km值为(0.223±0.030)mmol/L,V_(max)值为(1.272±0.121)μmol/(min·mg)。在pH值为6~10的缓冲液内酶活力仍保持在80%以上;在温度为40℃以下时,酶活较为稳定,但在温度高于40℃时酶活力迅速下降。RHA1能水解pNPR、橙皮苷和芦丁。【结论】RHA1具有良好的pH稳定性,不仅能够水解人工底物pNPR,还能够水解α-1,6键的天然底物橙皮苷和芦丁,具有一定的医疗应用价值。     

费氏丙酸杆菌在酸奶加工中的应用研究

研究了费氏丙酸杆菌在酸奶发酵过程中和贮藏期的酸度、黏度、脱水收缩率以及后酸化等指标的变化情况。研究结果表明,由费氏丙酸杆菌发酵得到的发酵乳的发酵周期长,需24h左右,黏度低,脱水收缩率高,口感欠佳,但共轭亚油酸质量浓度较高,达到119.16mg/L。将费氏丙酸杆菌发酵的酸奶在4℃下贮藏20d后,酸度增加了约6°T,后酸化能力弱,有利于酸奶的贮藏;贮藏结束时,酸奶中共轭亚油酸(CLA)的质量浓度为117.37mg/L,仍然处于较高水平。发酵周期长和黏度低等缺点可能会限制费氏丙酸杆菌在酸奶发酵中的应用。     

新型DNA聚合酶Tgo的扩增忠实性测定

用分子克隆技术从Thermococcus gorgonarius克隆并表达重组Tgo DNA聚合酶， 得到纯化的热稳定Tgo DNA聚合酶. 利用重组酶成功扩增了质粒pUC19、 野大麦Na⁺/H⁺逆向运转蛋白基因、 小鼠Cx37基因和人CYT2C9基因. 该酶的扩增性能与Taq酶相当， 而扩增忠实性分别比Taq酶、 Pfu酶高30倍和1.6倍.     

西宁地区市售牛奶中共轭亚油酸含量的测定与分析

共轭亚油酸(CLA)是一类双键位置和顺反构型不同的亚油酸的同分异构体,具有多种生物活性。应用紫外光谱法对西宁市售鲜牛奶和西宁、外地袋装纯牛奶中CLA含量进行测定。结果表明:所测产品中CLA含量在8.775±0.067~15.474±0.11 mg/g之间,西宁本地产鲜牛奶比西宁和外地产袋装纯牛奶CLA含量高,经方差分析差异显著(P<0.05)。常食用牛奶特别是西宁所售鲜牛奶可补充人体所需CLA。     

共轭亚油酸异构化技术研究进展

介绍共轭亚油酸(CLA)异构化技术的研究进展,评述异构CLA的碱性催化法、金属催化法和生物酶异构法.认为金属催化法效率高、成本低、经济环保,将成为今后工业化生产CLA的主要方法之一.构建高活性LA异构酶的基因工程菌是实现生物酶异构法产业化的重要前提.     

产共轭亚油酸乳酸菌的选育和鉴定

采用紫外分光光度法测定共轭亚油酸的含量,从13株实验室保存的乳酸菌中筛选出8株具有转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的菌株.其中As1.2686产量最高,发酵液中共轭亚油酸含量达到13.63 mg/L;其次是菌株B11693,共轭亚油酸产量为11.55 mg/L.选择B11693做进一步的菌种鉴定,将传统的形态学、生理生化鉴定方法和细菌16SrDNA分子生物学鉴定方法相结合,鉴定菌株B11693为短乳杆菌.     

羊腰部脂肪中共轭亚油酸提取及热稳定性

通过以羊腰部脂肪为原料,对比不同有机溶剂对油脂的提取效果,对比并确定油脂较佳提取条件及共轭亚油酸较佳提取效果,同时研究了温度对动物油脂中共轭亚油酸质量分数的影响.结果表明正己烷的油脂提取效果相比于石油醚、环己烷和无水乙醇较好,通过正交试验确定了较佳提取条件为提取温度为60℃,提取时间为4 h,V(溶剂)∶m(油脂)为8 L/kg.在较佳提取条件下,油脂提取率为88.72%,共轭亚油酸质量分数为6.31 mg/g.油脂中共轭亚油酸随温度升高有下降趋势,在130℃时质量分数略有增加.     

共轭亚油酸的生理功能

共轭亚油酸是一种新型的功能性脂肪酸,具有增强肌体免疫力、改善脂肪代谢、抑癌、降脂减肥、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病及改善骨组织代谢等多种生理功能;对共轭亚油酸的概念、生理功能及其机理等进行了综述。     

共轭亚油酸的氧化稳定性研究

共轭亚油酸（CLA）是亚油酸衍生的共轭二烯酸的所有异构体的总称,它是具有许多重要生理功能,如抗癌作用,抗粥状态动脉硬化,参与脂肪分解,调节新陈代谢等。本实验采用恒温洪箱法对碱碳化共轭,非内化共轭两种方法合成的CLA产品进行了氧化稳定性检测,结果表明CLA产品的氧化稳定性比其原料红花油要好地多,加入0．02％TBHQ则更进一步提高了产品的氧化稳定性。     

双羟基脂肪酸异构体的合成及谱学特征

 以共轭亚油酸甲酯为原料，与SeO₂反应，经可能的新反应机制合成了4个新的双羟基衍生物，分别是9,10(erythro) 双羟基 11 E 十八碳烯酸甲酯，10,11(erythro) 双羟基 12 E 十八碳烯酸甲酯，11,12(erythro) 双羟基 9 E 十八碳烯酸甲酯和12,13(erythro) 双羟基 10 E 十八碳烯酸甲酯，采用半制备正相高效液相色谱进行分离纯化，用LC/MS-MS和NMR对化合物结构进行鉴定，分析化合物的化学位移变化规律和质谱裂解规律，阐明其谱学特征。     

产共轭亚油酸微生物及发酵条件研究

对丙酸菌、乳酸菌等微生物发酵生产共轭亚油酸进行了介绍,并对其发酵条件做了综述和比对。     

辛烯基琥珀酸淀粉酯包埋共轭亚油酸工艺的研究

以辛烯基琥珀酸淀粉酯为壁材包埋共轭亚油酸,通过响应面法优化包埋条件,得到共轭亚油酸微胶囊化的最佳条件为芯壁比1∶2.87,包埋时间1.56h,包埋温度42℃,包埋率为93.22％.通过喷雾干燥得到共轭亚油酸微囊粉,在电子扫描显微镜下观察,粉末颗粒饱满紧密,排列整齐,颗粒表面出现无规则凹陷.