重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

类硫氧还蛋白hTRXL I cDNA的克隆和原核表达

从人18周胎脑中提抽mRNA，建立cDNA文库，通过大规模测序克隆出一条人类基因，该基因全长1644bp，开放阅读框1146bp，编码一个含372个氨基酸的蛋白，预测分子质量约为46．8ku，经与蛋白数据库比较，发现具有人硫氧还原蛋白结构，命名为人的类硫氧还蛋白基因I（human THioredoxin like gene I,hTRXL I)，多组织膜Northern blot结果显示在心脏，脑，胎盘，肝，骨骼肌，肾，胰腺等各个组织中均有表达，肺中表达不明显，通过Unigene染色体定位，将hTRXL I定位于11q11,把hTRXL I的读框克隆人经改造的PBV220质粒中，在E，coli中诱导后获得表达。     

酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...     

拟南芥Rad23原核重组蛋白构建和活性检测

在拟南芥中,Rad23基因通过参与泛素/26s蛋白酶体途径调节植物生长发育和激素应答.为进一步研究该基因编码蛋白的分子作用机制及其生物学功能,构建了pCold-Rad23融合蛋白重组表达载体,将该载体转化到大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明,分子质量为94 ku左右的融合重组蛋白在...     

拟南芥NOA1蛋白的原核表达和分析

通过构建AtNOA1的GST融合表达载体,在E.coli中表达AtNOA1蛋白,并分析不同诱导条件对AtNOA1蛋白表达的影响.结果表明,22℃是AtNOA1表达的最适诱导温度,而IPTG浓度在一定条件下变化对AtNOA1表达量无明显影响.     

人表皮生长因子原核表达及活性鉴定

人表皮生长因子(hEGF)是由53氨基酸组成的小分子多肽,它通过与膜受体的相互作用调节多种类型的细胞增殖。为获得具有生物活性的基因工程产品hEGF,设计在hEGF基因5’-端插入功能序列与基因融合,经合成基因、双酶切连接,构建了重组原核表达载体pBV-F-hEGF,并导入大肠杆菌HB101菌株。工程菌在37℃LB培养基中培养至对数生长期,并在42℃温度条件下诱导表达蛋白F-hEGF。以5 000 r/min离心收集细胞,利用超声波破碎细胞,以10 000 r/min离心20 min收集包涵体沉淀。含有F-hEGF的包涵体溶解后,采用Ni-NTA柱纯化目的蛋白,并用SDS-PAGE鉴定目的蛋白。利用免疫组化反应和MTT方法分析F-hEGF与其膜受体EGFR的特异性结合活性和细胞增殖活性。结果显示,融合蛋白F-hEGF得到高效表达,表达量在35%左右,纯化的蛋白浓度为3.1 mg/mL,F-hEGF与膜受体能发生特异性结合,具有明显的促细胞增殖活性。本研究构建了表达生物活性F-hEGF的工程菌,为hEGF进一步的临床和开发应用提供依据。     

麻疯树核糖体失活蛋白curcin基因的原核表达及其抗真菌活性的研究

通过PCR方法,将麻疯树核糖体失活蛋白curcin的开放阅读框片段从麻疯树总DNA中扩增出来.并将该克隆基因片段连接到原核表达载体pQE-30中,成功构建了重组质粒pQE-C,转化大肠杆菌M15菌株.经IPTG诱导后,curcin重组蛋白在大肠杆菌中成功表达.然后通过纯化原核表达产物,得到纯化的curcin重组蛋白,并以纸片法进行体外抗菌活性检测,发现其具有较强抗真菌活性.     

斑马鱼GAPDH蛋白片段的原核表达差异分析

为了分析斑马鱼GAPDH基因不同区域原核表达构建的诱导效应差异,应用生物信息技术分析斑马鱼GAPDH分子结构,通过定向删除技术,构建表达部分斑马鱼GAPDH蛋白片段的质粒。通过IPTG诱导,SDS-PAG检测,分析GAPDH基因不同区域构建的蛋白表达差异。结果:引物对ZGCKF/ZGCXR构建的GAPDH重组表达质粒具有IPTG诱导表达效应,而引物对ZGNKF/ZGNXR构建的质粒则不具有IPTG诱导表达效应。因此,为了在原核表达真核蛋白时应考虑过表达的真核蛋白是否会影响宿主的代谢以及是否会导致宿主的抵抗,设计引物时应当选择合适的区域构建重组质粒才能获表达产物。     

致病性鸡大肠杆菌pilA和外膜蛋白C原核诱导表达条件的优化

分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等条件对2种重组菌株BL21/pET - 28a - pilA和BL21/pET - 28a - ompC进行优化.得到最佳诱导条件:BL21/pET - 28a - pilA菌株为40℃摇培,80μL的接菌量,160r/min摇培2h后加入终浓度为0.96mmol/L的IPTG,再诱导表达4h,得到最高特异蛋白表达量;BL21/pET - 28a - ompC菌株为37℃培养,80μL的接菌量,160r/min摇培2.5h后加入终浓度为0.64mmol/L的IPTG,再诱导表达6h,得到最高特异蛋白表达量.     

AtbZIP19和AtbZIP23蛋白的原核表达

bZIP类转录因子参与调控多种生物学过程,包括植物生长、花的发育、种子的成熟、衰老、光信号传导、损伤修复、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应等。文章构建AtbZIP19和AtbZIP23基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了蛋白表达;提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR克隆AtbZIP19与AtbZIP23基因cDNA全长;将pET-32a+载体和聚合酶链反应(PCR)产物进行双酶切,通过DNA连接反应将2个基因定向克隆到pET-32a+质粒中;经菌液PCR和测序鉴定获得阳性克隆后,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达得到目的蛋白。     

玉米半胱氨酸蛋白酶的原核表达及酶学性质表征

以玉米基因组DNA为模板扩增获得玉米半胱氨酸蛋白酶基因(zmCP1),先将其克隆至pET-28a(+)原核表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.对重组酶进行诱导表达后经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blotting)鉴定,经Ni柱纯化后其质量分数大于95%.利用二肽荧光底物(R-AMC)和四肽荧光底物(LAFR-AMC)进行酶反应动力学实验,证明该酶对小底物R-AMC具有更好的亲和力和催化活性.重组酶的酶学性质研究表明,该酶最适温度为55℃,最适pH值为6.0,在90℃下的半衰期为39.82min.     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

pEGX-4T-2/NAP1融合蛋白的原核表达及鉴定

以鼻咽组织cDNA为模板,PCR扩增NAP1基因编码区,PCR产物克隆入pUCm-T载体,筛选阳性克隆. 构建NAP1基因编码区的原核表达载体pEGX-4T-2/ NAP1,转化大肠杆菌BL21. 经IPTG诱导表达后,在不同时段收集菌体,提取细菌的全部蛋白. 经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现细菌全蛋白中在35 KD～36 KD处多出一条明显条带. 用兔抗人NAP1多克隆抗体,利用Western Blotting对该融合蛋白的表达进行了鉴定,NAP1基因的融合蛋白表达成功,为制备NAP1单克隆抗体和获得有生物活性的NAP1蛋白,进一步研究NAP1蛋白的功能奠定了基础.     

赤红球菌JDM312环己酮单加氧酶的原核表达及检测

通过酶切法从重组质粒pUC18-chnB中得到编码环己酮单加氧酶的chnB基因序列,将其定向插入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-chnB,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达目的蛋白,用SDS-PAGE电泳检测表达产物.测序结果表明chnB基因大小为1 623bp,编码由540个氨基酸残基构成的多肽.S...     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

羊布鲁菌外膜蛋白Omp22的原核表达及鉴定

布鲁菌外膜蛋白Omp22与布鲁菌致病性相关,又可诱导机体免疫反应。为进一步研究Omp22的特性,对其进行原核表达,并初步鉴定。根据Genbank序列,设计并合成羊布鲁菌外膜蛋白Omp22引物。以羊布鲁菌M5株基因组DAN为模板,PCR扩增并克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中。酶切鉴定正确后,测定序列;将重组质粒pGEX-4T-1-Omp22电转化大肠杆菌DH5α中,诱导表达,并采用羊布鲁菌兔免疫血清,Western-blot初步检测融合蛋白GST-Omp22表达情况和免疫学特性。结果PCR扩增出约660bp目的条带,与预期相符;酶切鉴定和测序结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-Omp22原核表达载体;优化诱导温度,结果表明,在25℃诱导表达时,该融合蛋白大部分出现在上清中;Western-blot结果证实,GST-Omp22可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。说明成功构建了Omp22蛋白原核表达载体并进行了可溶性表达;该融合蛋白可与羊布鲁菌兔免疫血清特异性结合。Omp22蛋白的表达,为进一步研究布鲁菌的致病机制以及疫苗研制奠定基础。     

土鳖虫糖蛋白的提取及抗肿瘤活性初步研究

以新鲜的雌性土鳖虫原药材为研究对象,其水提物经乙醇沉淀,Sevag法除蛋白,DEAE-50纤维素离子交换层析柱等方法分离纯化后,得到糖蛋白组分,用糖蛋白组分分别对两种肿瘤Hela和食管癌Eca109细胞进行体外药物敏感性实验,结果显示,氯化钠洗脱浓度为0.4 mol/L时的洗脱峰组分在低浓度(<10 mg/L)水平对以上两种肿瘤细胞均有明显抑制作用,表明土鳖虫具有潜在的抗肿瘤作用.     

盐藻rbcS基因克隆及其原核表达

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Ribulose1,5-bisphosphate carboxylase／oxygenase,E,C．4,1．1．39简称RuBisCO）是光合作用中的关键酶,作者应用RT-PCR技术从一种极其耐盐的生物-杜氏盐藻的总RNA中克隆RuBisCO的小亚基（rbcS）的cDNA,它的开放读码框为570bp,编码190个氨基酸,将此cDNA定向克隆于原核表达载体pET-30a（＋）中,构建重组质粒pET-rbcS,经IPTG诱导,在大肠杆菌株BL21中表达．SDS-PAGE电泳表明,rbcS融合蛋白分子量约为26kDa．     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段的原核表达

取淋巴囊肿病病毒感染牙鲆组织,蛋白酶K裂解,PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段.构建其原核表达载体,IPTG诱导表达.结果表明,该融合蛋白分子量约70 kD,可与抗LCDV多克隆血清特异反应.为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础.