棉花腺体形成时均一化cDNA文库的构建

为克隆筛选棉花腺体形成相关的基因,运用SMART技术构建cDNA文库.首先抽提棉花腺体形成时期的mRNA,mRNA逆转录后合成cDNA,经均一化处理后,SfiⅠ酶切,连接质粒载体,电转化,成功构建了棉花腺体形成时期的cDNA文库.经鉴定原始文库滴度为5.8×105 cfu/mL,其重组率高达94%,插入片段的平均长度约为1.4 kb.     

全长cDNA文库构建方法及应用研究

构建全长cDNA文库是获得大量基因全序列信息的有效途径,也是进行功能基因组研究的一条经济、快速的途径,它克服了常规cDNA文库的缺点,极大地推进了功能基因组的研究,尤其是对于那些因基因组庞大而未能进行全基因组序列测定的生物来说更为重要．全长cDNA文库的研究在不断发展,几种文库构建方法已经建立,并得到了较为广泛的应用．本文重点阐述了全长cDNA文库的构建方法,对各种方法进行了分析和比较;同时对全长cDNA文库的应用也作了介绍．     

一种发现新基因的高效方法—cDNA文库的复性式均一化技术

由复性式均一化技术制作的均一化cDNA库（equailized cDNA library,normalized cDNA library）是近年来发展起来的一种获得EST,发现新基因的高效平台。本就该技术的原理,方法比较,存在问题和展望进行了阐述。     

褐飞虱取食水稻幼苗cDNA文库的构建及筛选

以褐飞虱取食 3 2 h的水稻幼苗为材料构建了 c DNA文库 ,初始文库含 3 .2× 1 0 6 个克隆 ,重组率为 86%,取 1 .0× 1 0 6个克隆子扩增一次 ,收集到 80 m L滴度为 1 .2× 1 0 9pfu/ m L的扩增文库 .随机挑取 2 0个克隆以 T7和 M1 3 reverse为引物进行 PCR扩增 ,以鉴定插入片段的大小 ,结果发现多数片段的长度在 1～ 4.0Kb左右 ,少数片段在 4Kb以上 ,个别片段在 6Kb左右 .以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的 ESTBp Hi0 0 8为探针 ,筛选 c DNA文库 ,得到该基因的 c DNA全长     

石斑鱼卵巢cDNA文库构建及脂肪酸结合蛋白克隆

应用SMARPTM技术构建了斜带石斑鱼Epinephelus coioides卵巢cDNA文库。所构建的cDNA文库滴度为4.5×106 pfu/mL,重组率为99％,扩增后文库的滴度为1.2×1010pfu/mL。把phagemid转化为质粒后,随机挑选60个阳性克隆进行酶切鉴定和测序。酶切结果表明:插入片段长度均在500~3 000 bp之间。测序结果经过生物信息学分析,发现其中一个克隆为脂肪酸结合蛋白(FABP)基因全长,并与人肝型(L)脂肪酸结合蛋白同源性最高,为70％。     

葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱蝇具有兼性滞育的特性且与果蝇近缘,是昆虫滞育分子机理和冬滞育和夏滞育专化基因比较研究的理想模式种,本研究目的在于构建葱蝇非滞育蛹的全长cDNA文库,为进一步的滞育专化基因筛选、克隆和表达分析奠定基础。利用RNAiso试剂提取葱蝇非滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,将限制性内切酶SfiⅠ消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,转化入大肠杆菌(DH10B),获得原始文库。经过涂平板测定表明,原始文库的库容量为2.3×107个单克隆;随机挑取15个单克隆,通过PCR快速鉴定,插入片段大小在0.4~1.2 kb之间,平均大小在0.9 kb,重组率达100%。这些结果表明本研究所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。     

植酸酶基因表达与调控机制研究(Ⅱ)──番茄幼苗cDNA文库构建与植酸酶基因筛选

采用异硫氰酸胍法从发芽３～４ｄ的番茄幼苗中提取出总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维素亲和层析分离纯化ｍＲＮＡ．以ｍＲＮＡ为模板,Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物用逆转录法合成双链ｃＤＮＡ．将ｃＤＮＡ与ＥｃｏＲＩ接头连接后克隆到表达载体λｇｔ１１的单一ＥｃｏＲＩ位点,经体外包装后感染宿主菌Ｙ１０９０,成功地构建了完整的番茄幼苗ｃＤＮＡ文库．用颜色筛选法筛选重组子,然后用植酸酶抗体做探针进行免疫筛选,得到两个阳性克隆．挑取阳性克隆噬菌斑扩增后纯化ＤＮＡ,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示确有外源ＤＮＡ存在．该插入片断序列测定正在进行．     

水稻幼叶及幼穗cDNA文库的构建及初步分析

为了克隆水稻第6染色体上S5位点的基因及包括广亲和基因在内的重要功能基因,以水稻Oryza sativa L.广亲和品种Cpslo17为材料,以λTriplex2TM为载体利用SMART技术构建了幼叶和幼穗2种器官的cDNA噬菌体文库.幼叶和幼穗原始文库的克隆数目为别为1.5×105 pfu和2.45×105 pfu,插入片段的大小均在500～3 000 bp之间,文库的阳性克隆子的为别比例为97.0%和98.7%.此文库的建立为克隆广亲和基因和其它重要全长功能基因奠定了基础.     

缺铁玉米根cDNA文库的构建及蛋白和cDNA差异比较

采用异硫氰酸胍酚氯仿法分离铁胁迫玉米根总ＲＮＡ,然后采用寡聚ｄＴ 纤维素层析柱法纯化Ｐｏｌｙ（Ａ） ＋ ＲＮＡ．用含有ＸｈｏＩ位点的ｌｉｎｋｅｒｐｒｉｍｅｒ 锚定合成ｃＤＮＡ 第一条链后,采用替代法合成第二条链,接着连接上ＥｃｏＲＩＡｄａｐｔｅｒ 以便定向重组到载体上．ｃＤＮＡ 经过ＸｈｏＩ消化和分级分离后,带有ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ粘性末端的ｃＤＮＡ 定向重组到λＺＡＰ表达载体的ＸｈｏＩ和ＥｃｏＲＩ位点上．经体外包装,重组的噬菌体转导宿主菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ,最终获得滴度为４－５ ×１０５ ｐｆｕ／ｕｇ 的λＺＡＰ 表达ｃＤＮＡ 文库．通过差异筛选法和质膜双向电泳验证了缺铁和加铁条件下ｃＤＮＡ 和质膜蛋白的差异     

烟草腺毛全长cDNA文库的构建

冻刷法收集烟草品种K326腺毛组织,Trizol法提取总RNA,采用SMART技术构建了烟草腺毛的全长cDNA文库.经鉴定表明,文库滴度为1.01×106pfu/mL,重组率为99.5%.随机选择24个阳性克隆进行插入片段测序,结果显示,插入片段长度在800~1 000 bp之间,将测得的序列进行Unigene归并和序列全长分析,得到了23条Unigene,21条序列有相关同源信息,其中14条为全长,完整性比率达到66.7%.结果表明,文库质量较好,可用于下一步基因克隆及基因表达谱的研究.     

经大肠杆菌感染的中国家蚕cDNA文库的构建

用建立非表达文库的方法,从大肠杆菌感染后９ｈ的中国家蚕的ｍＲＮＡ合成ｃＤＮＡ片段,重组入噬菌体λｇｔ１０的ＥｃｏＲＩ的位点之间,所构成的基因非表达文库库容量为２×１０６重组子,经大肠杆菌Ｃ６００与Ｃ６００ｈｌｆ菌株平皿测定,重组率为７６％．     

水稻黑条矮缩病毒基因组第九组分cDNA的克隆及序列分析

从我国发病的玉米材料中提取水稻黑条矮缩病毒,抽提病毒RNA,利用RT-PCR等手段,获得了病毒基因组第九组分（S9）cDNA克隆。序列分析结果表明：S9全长1900bp,含有2个不重叠的ORF,编码蛋白的分子质量分别为39.9,24.2ku,与日本株S9核苷酸序列同源性为89%,与意大利株MRDV S8同源性为86%。     

忽地笑(Lycoris aurea)叶片cDNA文库的构建与分析

用表达型噬菌体载体ZAP构建了忽地笑叶片cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1 BLUE,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。初始文库的滴度为5.6×105pfu/mL,扩增文库的滴度为6.9×109pfu/mL,含插入片段的频率为96%,插入片段大小在0.5～2.5kb,文库质量良好。为进一步从基因组学和分子生物学方面研究忽地笑叶片发育及克隆相关全长基因奠定了基础。     

氡染毒小鼠外周血细胞差异表达cDNA文库的构建和初步鉴定

构建氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因的cDNA文库。采用HD-3型多功能氡室对雄性BALB/C小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照实验动物吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(105WLM)和对照组(室内本底浓度,1WLM)。提取外周血细胞总RNA,采用SMART和抑制性消减杂交技术,构建正、反向消减cDNA文库,插入pMD18-T载体转化大肠杆菌,以含差异表达cDNA片段的菌液为模板进行巢式PCR扩增。获得了312个单克隆,成功构建了氡暴露小鼠外周血细胞差异表达的cDNA消减文库。