P185~(c-erBb-2)胞外区结构域在大肠杆菌BL21中的表达分析

以 PET-HT为表达载体 ,探讨在大肠杆菌 BL2 1中高效表达 P1 85c- er Bb- 2胞外区结构域蛋白的最佳条件 .经 SDS-PAGE与软件分析 ,确定其最佳表达时间为 3 h,当菌液密度为 0 .7时 ,所表达的蛋白含量最高 ,而 IPTG在一定浓度范围内对表达含量不产生影响 .     

P185c-erBb-2胞外区结构域在大肠杆菌BL21中的表达分析

以PET-HT为表达载体,探讨在大肠杆菌BL21中高效表达P185c-erBb-2胞外区结构域蛋白的最佳条件.经SDS-PAGE与软件分析,确定其最佳表达时间为3h,当菌液密度为0.7时,所表达的蛋白含量最高,而IPTG在一定浓度范围内对表达含量不产生影响.     

祛瘀和养阴不同功效中医经典方剂抑制CCl4诱导大鼠肝硬化的作用机制

探讨了祛瘀的下瘀血汤和养阴的一贯煎抑制CCl4诱导的大鼠肝硬化形成的不同作用机制.采用方法为给大鼠先皮下注射CCl4 3 mL/kg,然后注射50%CCl4橄榄油溶液2 mL/kg,每周2次,第9周开始随机将大鼠分为模型对照组、下瘀血汤组及一贯煎组,药物干预的同时继续CCl4诱导建立大鼠肝硬化模型,至12周末取材.检测指标为:肝组织病理学;肝组织羟脯氨酸含量;肝组织α-SMA,CD68,MMP-13,TIMP-1,TIMP-2蛋白表达;MMP-2,MMP-9的活性;肝细胞凋亡指数及Caspase-12,HGFα蛋白表达.结果显示:(1)与正常大鼠比较,模型大鼠8周时α-SMA,CD68,TIMP-1蛋白表达显著增加,12周时显著高于8周模型对照组;MMP-13,HGFα,TIMP-2蛋白表达逐渐降低,各时间点相互比较具有显著性差异;MMP-2,MMP-9活性4周时显著升高,8周时较4周略有升高,12周时显著高于8周模型对照组;肝细胞凋亡指数,Caspase-12蛋白表达量逐渐增加,且各时间点比较均具有显著性差异.(2)与同期模型对照组比较,干预组MMP-9活性及MMP-13,TIMP-2,HGFα蛋白表达量均显著增加,其中下瘀血汤组MMP-9,MMP-13显著高于一贯煎组,一贯煎组TIMP-2,HGFα显著高于下瘀血汤组;干预组MMP-2活性,TIMP-1蛋白表达显著降低,且一贯煎组显著低于下瘀血汤组;一贯煎组肝细胞凋亡指数,Caspase-12蛋白表达量显著减少.由此得出结论:祛瘀的下瘀血汤和养阴的一贯煎均可有效地抑制CCl4诱导的大鼠向肝硬化发展,下瘀血汤的主要作用在于提高MMP-9的活性及MMP-13的蛋白表达,其祛瘀作用的主要机制是促进胶原纤维的降解;而抑制肝细胞凋亡和肝星状细胞的活化是一贯煎养阴的主要作用途径.     

绿脓杆菌外毒素A与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白嵌合表达质粒的构建及其免疫原性的研究

构建外毒素结构域Ⅰ a基因(EPA103)与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-2-gD)嵌合蛋白表达载体(pET-EgD),得到嵌合表达蛋白.利用外毒素结构域Ⅰ a基因表达蛋白的佐剂效应,以pET-EgD表达嵌合蛋白免疫Balb/c小鼠.结果显示:嵌合表达蛋白(pET-EgD)免疫小鼠,可在小鼠体内诱导产生抗HSV-2特异性抗体.嵌合表达蛋白(pET-EgD)具有较强的免疫原性,为开发研究Ⅱ型单纯疱疹核酸疫苗奠定了基础.     

caveolin-1 siRNA对成釉细胞中CD147糖基化及MMP-2表达的影响

目的:研究caveolin-1的表达对小鼠成釉细胞CD147糖基化及MMP-2表达的影响.方法:首先利用细胞免疫荧光技术检测体外培养的小鼠成釉细胞中caveolin-1、CD147和MMP-2蛋白的表达;然后利用siRNA技术封闭小鼠成釉细胞中caveolin-1的表达,实时定量荧光PCR和免疫印迹试验分别检测caveolin-1、CD147和MMP-2在转录水平和蛋白水平的表达情况,并统计学分析.结果:caveolin-1、CD147和MMP-2蛋白表达于体外培养的小鼠成釉细胞中;caveolin-1siRNA转染成釉细胞后caveolin-1mRNA和MMP-2mRNA的表达量明显降低,但CD147mRNA的表达量没有明显变化;caveolin-1、高糖型CD147和MMP-2的蛋白表达量均降低.结论:caveolin-1、CD147和MMP-2表达于小鼠成釉细胞中,提示3者参与成釉细胞生物学过程;在体外培养的成釉细胞中,封闭caveolin-1基因的表达可降低HG-CD147和MMP-2的表达.     

pMAL-p2X系统表达SLA-Ⅰ复合体蛋白

SLA-Ⅰ/pMAL-p2X为人工构建的原核表达体系.为获取最佳表达的SLA-Ⅰ复合体蛋白及其可溶性表达含量,设计实验对其进行表达优化(pH值、温度、菌体密度、IPTG浓度、诱导时间),SDS-PAGE检查目的蛋白的表达.另外检查目的蛋白的可溶性表达含量.结果显示,SLA-Ⅰ在pMAL-p2X的最佳表达条件为pH=8.0、T(温度)=37 ℃、OD600=1.0、IPTG=0.4 mmol/L和t(诱导时间)=5 h;证明目的蛋白可溶性表达含量占总表达蛋白的70%左右.研究表明pMAL-p2X系统适合于生产可溶性的SLA-Ⅰ复合体蛋白,便于今后进一步研究SLA-Ⅰ类分子结构和功能.     

编码拟南芥含BAG结构域蛋白的原核表达载体构建

生物信息学分析显示,拟南芥基因At5g62390编码一种钙调素结合蛋白,在其钙调素结合结构域有一个BAG(Bcl-2-associated athnogene)结构域存在,与钙调素结构域部分重叠.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特征及BAG结构域在钙调素结合中可能的调节作用,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增不同结构域编码区的cDNA序列,构建到原核表达载体pET32-a中.测序分析表明:目的序列已正确克隆到表达载体上,为进一步表达目的蛋白及其不同结构域用于生化功能鉴定打下了基础.     

祛瘀和养阴不同功效中医经典方剂抑制CCl4诱导大鼠肝硬化的作用机制

探讨了祛瘀的下瘀血汤和养阴的一贯煎抑制CCl₄诱导的大鼠肝硬化形成的不同作用机制.采用方法为给大鼠先皮下注射CCl₄ 3mL/kg，然后注射50% CCl₄橄榄油溶液2mL/kg，每周2次，第9周开始随机将大鼠分为模型对照组、下瘀血汤组及一贯煎组，药物干预的同时继续CCl₄诱导建立大鼠肝硬化模型，至12周末取材.检测指标为：肝组织病理学；肝组织羟脯氨酸含量；肝组织α-SMA，CD68，MMP-13，TIMP-1，TIMP-2蛋白表达；MMP-2，MMP-9的活性；肝细胞凋亡指数及Caspase-12，HGFα蛋白表达.结果显示：（1） 与正常大鼠比较，模型大鼠8周时α-SMA，CD68，TIMP-1蛋白表达显著增加，12周时显著高于8周模型对照组；MMP-13，HGFα，TIMP-2蛋白表达逐渐降低，各时间点相互比较具有显著性差异；MMP-2，MMP-9活性4周时显著升高，8周时较4周略有升高，12周时显著高于8周模型对照组；肝细胞凋亡指数，Caspase-12蛋白表达量逐渐增加，且各时间点比较均具有显著性差异.（2） 与同期模型对照组比较，干预组MMP-9活性及MMP-13，TIMP-2，HGFα蛋白表达量均显著增加，其中下瘀血汤组MMP-9，MMP-13显著高于一贯煎组，一贯煎组TIMP-2，HGFα显著高于下瘀血汤组； 干预组MMP-2活性，TIMP-1蛋白表达显著降低，且一贯煎组显著低于下瘀血汤组；一贯煎组肝细胞凋亡指数，Caspase-12蛋白表达量显著减少.由此得出结论：祛瘀的下瘀血汤和养阴的一贯煎均可有效地抑制CCl₄诱导的大鼠向肝硬化发展，下瘀血汤的主要作用在于提高MMP-9的活性及MMP-13的蛋白表达，其祛瘀作用的主要机制是促进胶原纤维的降解；而抑制肝细胞凋亡和肝星状细胞的活化是一贯煎养阴的主要作用途径.     

伴CSM改变的结直肠腺瘤基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的表达

目的:探讨伴鸡皮样粘膜(chicken-skin mucosa,CSM)改变的结-直肠腺瘤、腺癌中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA的表达及临床意义.方法:采用免疫组化S-P法检测37例伴CSM结-直肠腺瘤、24例腺癌标本中MMP-2、MMP-9蛋白,原位杂交法检测MMP-2、MMP-9 mRNA的表达.结果:MMP-2在腺瘤伴轻、中度不典型增牛组(AD1)、腺瘤伴重度不典型增生组(AD2)的表达与正常肠粘膜相比不具有统计学意义(P>0.05),在腺癌(CA)中其表达高于正常肠粘膜(P<0.05);MMP-9的表达在AD1、AD2与CA组高于正常肠粘膜(P<0.05),在CA中其表达并不进一步增强.结论:MMP-2可能是伴CSM腺瘤向腺癌转变途径中的早期事件,其表达在腺癌中并不进一步增强;MMP-9在腺癌中开始表达,这可能是腺瘤细胞获得浸润能力、腺癌细胞获得转移能力的机制之一.     

P-5m八肽对肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9表达的抑制作用

目的探讨P-5m八肽对肝癌HepG2细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响,以及P-5m八肽的抗肿瘤作用机制.方法用终浓度为10μmol/L和100μmol/L的P-5m八肽分别对处于对数生长期的HepG2细胞进行处理,药物作用时间为36 h,36 h后将细胞裂解.采用Real-time PCR方法检测给药后细胞中MMP-2和MMP-9 m RNA表达水平的变化;Western blot方法测定MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化.结果Real-time PCR检测显示终浓度为10μmol/L和100μmol/L的P-5m八肽对HepG2细胞刺激后,MMP-2和MMP-9的m RNA表达均受到抑制,与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05);Western blot检测结果表明:用10μmol/L和100μmol/L的P-5m八肽对HepG2细胞刺激后,MMP-2和MMP-9的蛋白表达均受到抑制,与对照组比较差异具有统计学意义(P0.05).结论 P-5m八肽可明显抑制HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的表达.     

Cloning and molecular characterization of a gene encoding MAP kinase from maize and its expression in E. coli

A new MAPK gene, ZmSIMK1 （Zea mays L. salt-induced mitogen-activated protein kinase 1）, is isolatod from a maize eDNA library. The full-length ZmSIMK1 gene contains 1636 bp and an open reading frame of 1122 nucleotides capable of eneoding 373 amino acid polypeptides with a predicted molecular mass of 42.3 kda and pI of 6.01. The putative ZmSIMK1 protein contains all 11 conserved subdomains that are characteristics of serine/threonine protein kinases and the TEY motif, which is the putative phosphorylation site. Northern blot analysis shows that ZmSIMK1 is ubiquitously expressed in roots, stems, and leaves of maize seedlings and its mRNA accumulation is observed in maize seedlings treated with 30 mmol/L PEG-6000 and 137 mmol/L NaCl, but the expression of ZmSIMK1 is not significantly affected by 4℃ treatment. The expression vector pET-ZmSIMK1 is constructed by inserting the coding region of ZmSIMK1 eDNA into pET-42a（＋）, and transformed into E. coli strain BL21（DE3）. A 77kda fusion protein is induced by the further culture at 37℃ after addition of 1 mmol/L IPTG.     

Cloning, prokaryotic expression,purification and sequence analysis of 20S proteasome subunit gene from T.harzianum

The gene encoding the 20S proteasome subunit（PR29） was cloned from cDNA library of Trichoderma harzianum and expressed in Escherichia coli BL21 （D3） using a pET-28a expression system. The molecular weight of the protein was found to be approximately 29 kDa, as estimated by SDS-PAGE on gels. The target protein was insoluble when induced at 22℃ with 0.4 mmol/L IPTG, while dissoluble if induced at 37℃ with 0.8mmoL/L IPTG. The expressed product was purified through Ni-magnetic beads His Bind. The purity of the fusion protein reached above 80%. The entire eDNA sequence consisted of 1094 bp with 173 and 135 bp in 5＇ and 3＇ untranslated regions respectively. The gene encoding 261 amino acids has no signal peptide sequence. These results could provide a basis for validating the func-tions of PR29. It also provided a preliminary indication for further study of the mechanism and function of proteasome, and more information of proteasome mechanism in T.harzianum could be obtained.     

鱼腥藻铁调蛋白基因(alr0957)表达和Fe~(3+)对藻生长的影响

根据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 FurC基因(alr0957)序列信息设计特异性引物,用降落PCR法从染色体DNA中扩增得约450 bp目的片段.运用TA克隆将其连接到pMD18-T载体上,经筛选测序获得阳性重组质粒.再经过双酶切、纯化FurC基因,连接原核表达载体pET-28a(+),并转化表达菌株BL21和IPTG诱导表达.经测序鉴定的阳性菌株中的FurC,运用SDS-PAGE检测重组蛋白,并利用镍柱层析法纯化目的蛋白.由藻细胞密度、叶绿素a含量、可溶性糖含量等改变探讨不同Fe3+浓度对藻类生长的影响.结果表明:在37℃经1 mmol/L IPTG诱导18 h,成功表达了分子量约为19000的融合蛋白.小于0.5mg/L Fe3+促进藻生长,大于0.9 mg/L Fe3+抑制藻生长,最适藻生长Fe3+浓度为0.5⁰.9 mg/L.     

转MT工程菌的构建及其对重金属的抗性研究

利用重叠延伸PCR技术克隆金属硫蛋白(MT)和绿色荧光蛋白(GFP)基因片段,并将两基因融合连接构建重组表达载体,采用氯化锂法转化毕赤酵母,获得工程菌株.荧光显微镜观察发现,工程菌在蓝光激发下发出绿色荧光,说明GFP基因被正确表达.在培养基中加入一定浓度的铜(1.0 mmol/L,1.5 mmol/L)、铬(150 μmol/L,200 μmol/L)、镉(120 μmol/L,140 μmol/L)、砷(40 μmol/L,60 μmol/L)化合物后,对照菌生长抑制,转基因菌株长势明显好于对照菌,表现出对金属离子的耐受性,说明工程菌过表达MT能够增强宿主对重金属离子的耐受性,提高菌株耐污能力,在微生物法净化重金属废水中具有一定优势.     

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

采用Mut^s表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油—甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g／L,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mmol／L时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH调节方式并在发酵后期添加25mmol／L(NH4)2SO4使发酵液中铵离子浓度维持在150mmol／L以上,血管生长抑制素的表达产量达到108mg／L。     

Molecular cloning, in vitro expression and enzyme activity analysis of violaxan-thin de-epoxidase from Oryza sativa L.

The violaxanthin de-epoxidase gene was cloned from rice (Oryza sativa subsp. japonica). The full length of the cDNA is 1887 bp, encoding a 446-amino acids protein with the transit peptide of 98 amino acids. The bacterial expression vector pET-Rvde was constructed and the expression quantity of the exogenous protein increased with the induction time by 0.4 mmol/L IPTG. Its molecular weight was similar with that of the native VDE. Western blotting indicated that the expressed protein has immunological reaction with the VDE polyclonal antibody. The absorbance spectrum together with xanthophyll pigments quantification by HPLC demonstrated that the expressed VDE has its enzyme activity, which can de-epoxidate violaxanthin into antheraxanthin and zeaxanthin in vitro.     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

棉花类耐盐锌指蛋白基因的克隆与结构分析

从棉花花瓣cDNA文库中随机挑选部分克隆，经测序发现一个与拟南芥耐盐锌指蛋白基因同源的cDNA(CSTZ),CSTZ序列全长1012bp，开放阅读框共编码272个氨基酸，含典型的植物双锌指（Cys2/His2)结构区，Northern杂交证实，CSTZ的表达随棉花幼苗钠盐处理浓度的升高而增强，在棉花花龄期，CSTZ基因在叶片，根，花瓣和花药组织中大量表达，在柱头组织中表达相对较弱。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的克隆与表达

利用分子生物学方法对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因进行克隆与表达.培养菌体后提取总DNA,用PCR法扩增其亚油酸异构酶基因,再将其克隆到pET30a载体上,转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,并用Ni2 金属鳌合层析对重组蛋白进行分离和纯化.通过实验,得到了亚油酸异构酶的基因,成功转入到载体中,表达出了可溶性的重组蛋白,并对其进行了纯化.实验表明,在原核细胞中可以表达出可溶性重组亚油酸异构酶,以200 mmol/L的咪唑洗脱液进行洗脱可以获得目标蛋白.