酶联免疫吸附分析双抗夹心法检测临床鼻咽抽吸物中呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起5周岁以下儿童下呼吸道感染的主要病原体.目前常用的试剂盒是美国Diagnostic Hybrids公司研发的7项呼吸道病毒检测试剂盒,但其价格昂贵,且需荧光显微镜辅助诊断,不利于在基层医疗机构中推广,国内尚无上市的快速诊断试剂用于临床检测.为此建立用于RSV抗原检测的早期快速诊断试剂,并以反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测为参比,同时使用酶联免疫吸附分析(ELISA)双抗夹心法和免疫荧光法对112份临床鼻咽抽吸物(NPA)样本进行检测.ELISA双抗夹心法和免疫荧光法的灵敏度分别为79.31%和74.14%,特异度分别为100%和96.30%,Kappa值分别为0.787 1和0.689 5,两者均与RT-PCR检测结果具有高度一致性.此外,将ELISA双抗夹心法与免疫荧光法比较,两者无显著差异(p0.05).综上,ELISA双抗夹心法操作简便,特异性高,有望代替进口检测试剂盒完成RSV感染的早期快速诊断.     

大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.     

鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100—109拷贝),最低检测限度为4拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。     

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 gB基因设计特异引物和TaqMan探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4．5mmol／L,400nmol／L和500nmol／L．同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100％,CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测,结果全为阴性．试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

九味羌活丸和香砂养胃丸制剂米粉掺伪检测方法的建立和质量标准的制定

目的:建立荧光探针PCR检测方法并拟定质量标准,旨在实现快速、准确地检出九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)中的掺伪米粉.方法:通过优化样品提取方法,有效提取九味羌活丸和香砂养胃丸复方的基因组;通过文献检索和生物信息学分析,筛选得到适用于本试验的米粉特异性引物和TaqMan探针,并优化PCR检测方法.实验对方法的特异...     

应用实时荧光定量PCR方法检测实验用猫巴尔通体的感染

目的 建立高效特异的巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法,并应用于实验用猫的微生物检测工作中。方法 针对NCBI公布的巴尔通体序列设计特异引物和TaqMan探针,使用分子生物学方法制备质粒标准品,建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;对该方法的线性、敏感性、特异性及稳定性进行测定;并使用该方法对142个猫样品进行检测。结果 成功建立巴尔通体实时荧光定量PCR方法;该方法线性范围为1.0×101 copies/μL～1.0×109 copies/μL,相关系数为0.998,检测极限达10 copies/μL;特异性结果显示所建方法具有良好的特异性,并在142份实验用猫样品中检测出阳性样品6份。结论 实时荧光定量PCR方法可用于实验用猫巴尔通体的检测工作中。     

快速敏捷检测人乳头瘤病毒基因型的实时荧光PCR方法

宫颈癌是女性最常见的一种恶性肿瘤,研究表明人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关.采用实时荧光PCR技术对引起宫颈癌的两种主要HPV亚型HPV16和18型阳性质粒进行检测,在实验室中成功构建了HPV16和18型的检测体系以及体外模拟的双重感染检测体系,并对三例临床确诊为宫颈癌的标本进行实时荧光PCR验证检测,确定三例标本均为高浓度HPV16型感染,极易引起宫颈癌变,与医院诊断结果相符合.本实验为实时荧光PCR技术检测HPV16和18型的临床检验在实验室中成功地进行了探索,为实时荧光PCR技术在宫颈癌大规模筛查上的应用提供了研究基础.     

PCR技术检测致病真菌感染的研究

目的建立适合临床实践的常见致病真菌的PCR检测方法。方法根据真菌的保守基因设计不同的特异性引物,对152例临床标本进行PCR检测,与传统检验方法的结果进行比较。结果真菌培养阳性46例;真菌PCR检测阳性57例,分别为白色念珠菌感染30份、烟曲霉感染9份、黄曲菌感染8份,其他真菌感染10份。两种方法比较,检出率差异无统计学意义。结论 PCR法可快速、特异、灵敏地检测致病真菌,适合临床实验室的快速诊断。     

人源IFITM2基因检测方法的建立及EMCV感染对IFITM2基因转录的影响

目的:建立一种干扰素诱导跨膜蛋白2(IFITM2)基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,以期为IFITM2基因的动态监测提供有效的检测技术.方法:根据GenBank中公布的IFITM2基因序列设计特异性引物,以质粒pMD18-T-IFITM2为模板进行条件优化,绘制标准曲线,建立IFITM2基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行条件优化与评价,用建立的方法对脑心肌炎病毒感染后细胞中IFITM2基因转录水平进行检测.结果:建立的20μL检测体系中IFITM2基因最佳引物浓度为10μM,最佳退火温度为59℃;标准质粒在2.62×10~5～2.62×10~(10)copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好线性关系,线性方程y=-3.495 logx+43.12,R~2=0.998,且灵敏性、特异性和重复性均较高.应用建立的方法对EMCV感染细胞中IFITM2基因转录水平进行检测,结果显示,在感染早期IFITM2转录水平不变,感染后期转录水平逐渐升高.EMCV感染引起宿主IFITM2基因转录水平的变化,可能与EMCV逃逸宿主相关免疫应答有关.结论:成功建立了一种快速、准确检测IFITM2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.该方法的建立,为进一步研究IFITM2在EMCV感染过程中的作用奠定了基础.     

KIF4A mRNA在肺癌组织中表达水平的研究

收集肺癌组织标本和正常肺组织标本,提取组织中的RNA,通过反转录PCR合成cDNA,进行实时定量PCR测定.结果表明:31例肺癌组织中有29例KIF4A mRNA的表达量高于正常组织,其中26例(83.87%)比正常组织高2倍以上,10例(32.30%)比正常组织高4倍以上;KIF4A mRNA的表达量与肿瘤淋巴结转移(TNM)分期的相关性具有统计学意义(F=0.565,P=0.029).由于肺癌组织中KIF4A mRNA的表达量升高与肿瘤的分期分型相关,因此可以作为判断肺癌分期及预后的新分子标志物,对于评估肺癌的发生与发展也可能具有重要意义.     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.     

马铃薯卷叶病毒基因组保守序列片段的RT—PCR扩增

从感染马铃薯卷叶病毒的植株中提取马铃薯卷叶病毒总RNA,针对马铃薯卷叶病毒基因组,其中的2个保守序列分别设计并合成了1对寡聚核苷酸引物,用反转录-聚合酶链式反应方法从提取的病毒RNA材料中扩增出符合设计大小的240bp、400bp的特异性产物,对照的健康植株中未扩增出相应产物。     

甲基乙二醛诱导牙周膜成纤维细胞基因表达与分析

运用基因芯片研究甲基乙二醛诱导人牙周膜成纤维细胞基因表达谱的变化。原代培养人牙周膜成纤维细胞,诱导组以终质量浓度为0.1 g/L的甲基乙二醛刺激培养细胞,对照组不含甲基乙二醛。24 h后收获细胞,提取mRNA,逆转录cDNA时用Cy3和Cy5荧光染料标记,制备成cDNA探针,与表达谱芯片进行杂交、扫描和分析。芯片检测结果用实时定量聚合酶链反应验证和生物信息学分析。结果共有18条基因显著差异表达,其中上调基因有11条,下调基因有7条,差异性表达的基因按功能可分为程序性细胞死亡、信号转导、细胞因子、代谢酶类、载体蛋白和未知基因等。与程序性细胞死亡、信号转导和细胞因子相关基因的差异表达可能是甲基乙二醛通过线粒体信号通路,诱导人牙周膜成纤维程序性细胞死亡,破坏牙周组织增生,从而导致牙周病发生的机制。     

DNA的不同提取方法对转基因产品定值的影响

国内外非常重视转基因产品的检测工作,主要依赖于DNA的PCR方法进行检测,其检测结果可靠、稳定、灵敏度较高。尤其在转基因产品的定值实验中,荧光定量PCR的应用起到重要的作用,但是DNA的质量是保证荧光定量PCR定值准确的关键。实验以100%的克螟稻为材料,用CTAB法、商品化的Promega、Qiagen以及TIANGEN提取试剂盒,分别提取克螟稻基因组DNA,经过核酸蛋白分析仪初步测定浓度、纯度以及离子浓度后,分别以水稻内源基因PLD和克螟稻特异性转化体引物及探针实施荧光定量PCR实验,以100%克螟稻为盲样实施定值,来确定一种更适合荧光定量PCR定值实验的DNA提取方法,最终确定Qiagen和TIANGEN提取试剂盒满足荧光定量PCR对100%的克螟稻标准物质定值实验的要求。     

染色质免疫沉淀技术（ChIP）在基因转录调控中的作用

目的研究体细胞水平蛋白（转录因子）与DNA（靶基因启动子区）的相互作用.方法用甲醛固定活细胞,在生理状态下,结合的蛋白质-DNA复合物呈交联状态,超声将DNA打断成不同大小的片段,用目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀该蛋白质-DNA复合物,复合物65℃解交联,并分离纯化DNA,然后进行PCR扩增.结果PCR扩增出阳性条带.结...     

玉柏石松中甾体化合物对体外培养成骨细胞活性的影响

为研究玉柏石松中甾体化合物豆甾烷-3-酮-21-羧酸（SA）对体外培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1活性的影响,用Alamar Blue法检测了成骨细胞增殖率,碱性磷酸酶试剂盒检测了细胞中碱性磷酸酶活性,茜素红染色检测了成骨细胞矿化水平,荧光定量PCR检测了成骨细胞骨分化相关基因的表达.结果显示：8μmol/L和16μmol/L的SA处理细胞8 d能抑制成骨细胞碱性磷酸活性;处理细胞16 d能提高骨细胞矿化水平.SA抑制成骨早期分化相关基因（Runx-2和Osterix）的表达,促进骨基质蛋白OPN和骨重建相关转录因子（Jun-D,Fra-1和Fra-2）的表达.故SA具有促进骨折愈合的成骨活性,可能通过促进相关转录因子表达,骨折断面旧骨的吸收和骨基质钙化等方式完成.     

乐至黑山羊催乳素受体基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中绵羊催乳素受体（PRLR）基因序列（AF041257.1）设计1对引物,以乐至黑山羊脑垂体总RNA为模板,通过RT-PCR技术对乐至黑山羊PRLR基因cDNA克隆测序和序列分析.结果表明：扩增出的乐至黑山羊PRLR基因cDNA序列长为1743bp,编码581个氨基酸.乐至黑山羊与绵羊、牦牛、欧洲牛、野猪和人的核苷酸同源性分别为：98.34％、94.67％、94.27％、77.48％、74.33％.以核苷酸序列构建分子进化树,乐至黑山羊先与绵羊聚为一类,再与欧洲牛和牦牛聚为一类,而后与野猪聚为一类,最后与人聚为一类.     

猪繁殖与呼吸障碍综合征的RT-PCR诊断

根据猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的全基因组序列,设计合成一对特异性引物,建立检测PRRSV的RT-PCR方法。对两份疑似病料进行检测,结果两份均为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性。结合流行病学,临床症状以及病理解剖变化,诊断为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒感染。     

鸡胚致死孤儿病毒PCR检测方法的建立及应用

目的建立鸡胚致死孤儿病毒PCR检测方法,并应用于鸡胚及禽源性生物制品的检测。方法根据鸡胚致死孤儿病毒长纤突保守序列分别设计3对引物,优化并建立鸡胚致死孤儿病毒PCR检测方法;分别采用该方法对SPF鸡胚和流感疫苗、麻疹疫苗进行检测。结果建立的方法可检测到10-9稀释的病毒DNA;该方法与鼠腺病毒及猴腺病毒无交叉反应;在SPF鸡胚及禽源性生物制品中应用该方法均未检出病毒。结论该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于禽源性生物制品中鸡胚致死孤儿病毒的检测。