用生物信息学方法发现跨染色体剪接的嵌合5′/3′UTRs

mRNA的5′/3′ UTRs是在mRNA翻译过程中起重要调控作用的序列, 在5′/3′ UTRs上不正常的剪接模式可能导致多种严重疾病. 提出了一种基于大规模序列比对分析搜寻5′/3′ UTRs跨染色体剪接现象的方法, 并用此方法得到8例可信度高的跨染色体的5′/3′UTRs剪接事件, 从信息的角度证实了来自不同染色体序列剪接成为5′/3′ UTRs的现象是真实存在的. 对这8例跨染色体剪接产生的5′/3′ UTRs用多序列比对在剪接区域没有发现一致保守的motif. 同时, 目前的预测算法也不能在剪接区域检测到特异性的RNA二级结构, 因此很难确定引导5′/3′ UTRs跨染色体剪接的信号.     

我国科学家发现基因剪接调控新机制

正mRNA选择性剪接是真核生物中基因表达的一种高效、精准的调控机制,它是指剪接体通过在mRNA前体上的识别定位,准确地切除内含子序列,将不同的外显子序列拼接到一起,产生不同的成熟mRNA转录本.选择性剪接是形成结构和功能多样的蛋白质的重要物质基础,至少90%的人类基因都存在选择性剪接,在细胞生长和组织分化等方面发挥关键作用.选择性剪接产物的自然平衡是维     

反义核酸对β-地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究

β-珠蛋白基因第2个内含子(IVS-2)中第654位核苷酸(nt654)C→T剪接缺陷型突变是中国人最常见的β-地中海贫血(简称β-地贫)突变类型之一.我们先前的研究表明,该突变在IVS-2第654位(nt654)上出现的单碱基取代产生了一个新的 GT二核苷酸,它联同旁侧序列构成了一个5＇异常剪接位点,同时还激活了IVS-2第579位(nt579)处3＇隐匿剪接位点,从而将 IVS-2nt580至 nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入外显子2和外显子3之间,产生了异常的β-珠蛋白mRNA,导致β~ -地贫.为了探讨反义核酸治疗β-地贫IVS-2-654 C→T突变的可能性,我们应用体外转录和体外剪接系统,以体外转录产生的特异反义RNA封闭IVS-2-654 C→T突变基因中3＇隐匿剪接位点和5＇异常剪接位点,使之失去活性,从而减少异常加工的mRNA并且部分恢复了正常剪接途径.     

玉米、二倍体多年生类玉米及其杂交后代异染色质纽重复序列在染色体上的分布

利用组成玉米异染色质纽的180-bp重复序列和TR-1元件以及45S rDNA对二倍体多年生类玉米(Zea diploperennis Iltis Doebtey, DP)、玉米自交系F102及其远缘杂交后代的有丝分裂中期染色体进行了定位. 在DP中, 第1和4染色体的短臂以及第4和5染色体的长臂上的异染色质纽只有180-bp重复序列信号, 此外, 在第2和5染色体的短臂以及第2, 6, 7, 8和9染色体的长臂同时检测到180-bp重复序列和TR-1的信号. 在玉米自交系F102中, 180-bp重复序列信号出现在第7染色体短臂和第8染色体一个成员的长臂, TR-1信号是在第6染色体的随体上, 该玉米自交系中没有观察到双重复序列同时出现的现象. 两物种间, 180-bp重复序列和TR-1元件信号大小、数目和染色体分布存在多态性, 同一种内部分同源染色体之间具有异态性. 以这些细胞学标记为探针, 玉米和DP种间杂交后代得以鉴定. 180-bp重复序列和TR-1元件比较定位分析有助于了解玉米属基因组间的结构和进化关系.     

水稻RAD21同源基因(OsRIX4)存在多种mRNA选择性剪接模式

稻RAD21同源基因(OsRIX4)存在着多种mRNA选择性剪接模式, 从中鉴定出一类特殊的剪接模式, 即一个组成型外显子内部的部分片段可以被单独剪除, 该类型不属于已知的5类剪接模式之一.这种剪接模式所产生的转录本能够独立地得到翻译. OsRIX4基因多转录本的表达各具组织特异性, 其中OsRIX4-4和OsRIX4-5转录本的表达量与水稻育性呈正相关. 这种剪接模式的发现, 可以为理解和定义植物mRNA剪接模式提供新的内容, 也凸显转录后mRNA加工和调控机制的复杂性.     

葡萄与柴胡科间体细胞杂交再生杂种植株

狭叶柴胡原生质体用强度为 2 6 0 μW/cm2 紫外线照射 0 ,1 ,2和 3min后 ,与酿酒葡萄原生质体融合 .对融合再生的 1 9个单细胞克隆进行表型、同工酶、染色体和 5SrDNA间隔序列分析 .结果表明 ,它们均为体细胞杂种 . 1 1个杂种愈伤组织包括对称及不对称融合产物 ,在培养 5个月时 ,再生了体细胞胚、幼叶及叶丛 ;其中有 4个不对称融合的杂种细胞系在培养8～ 1 0个月后 ,再生出有根的完整小植株 .染色体观察表明 ,完整植株的再生与杂种细胞的染色体数目相对减少相关 .对部分小植株幼叶的核糖体 5SrDNA间隔序列差异的分析 ,证实它们为科间体细胞杂种 .     

基于剪接信号和调节元件序列特征的剪接位点预测方法

结合剪接相关的剪接信号和调节元件的序列特征信息, 发展高效的剪接位点预测方法, 是真核生物基因预测中一个新课题. 运用熵密度分布(EDP)距离方法、权重数组法(WAM)、κ检验等算法建立了剪接位点相关的剪接信号的统计模型, 同时基于无监督自学习的基序检测方法建立了调节元件的统计模型, 在此基础上设计了基于多层次支持向量机(SVM)的剪接位点预测新算法, 实现了真核基因剪接位点的从头(ab initio)预测. 对人类基因组剪接位点数据的大规模测试结果表明, 本研究提出的方法能够有效地预测人类基因组中的剪接位点, 预测水平不仅全面高于传统的基于剪接信号的预测方法GeneSplicer, 而且在总体预测精度上达到并大部分超过基于调节元件信号的预测方法SpliceScan. 对于低GC含量的基因序列, 本文方法的预测精度明显地高于其他两种方法.     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在人体纤溶与凝血的平衡调控中发挥重要作用,而且在治疗心血管栓塞性疾病方面具有广阔的应用前景.t-PA在人体内的表达受严格调控,其mRNA具有较长的非翻译区序列.我们曾报道了t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控,为研究长约209nt的5′-UTR序列对t-PA表达的影响.本文采用反转录-PCR技术从黑色素瘤细胞中克隆出t-PA cDNA 5′端序列,在体外和体内2个系统中研究了5-′UTR序列对t-PA表达的影响.     

水稻mRNA多聚腺苷化信号位点的序列分析

大部分真核生物mRNA的加工涉及到mRNA前体的分裂/多聚腺苷化, 在3′-末端形成多聚腺苷酸(poly(A))尾巴. 为了研究水稻mRNA前体多聚腺苷化过程所必需的poly(A)加尾信号、下游调控元件和poly(A)位点等序列的特点, 用3′-末端带有poly(A) 的EST与全长cDNA序列进行比较, 建立了一个来自9953个基因的、覆盖12969条poly(A)位点两侧各40碱基序列的数据库. 结果发现, 只有7.9%的mRNA使用AAUAAA作为加尾信号, 超过60%使用AAUAAA的1~2个碱基变化的序列作为加尾信号, 11.5%的mRNA使用AAUGAA及其单碱基变化的加尾信号. 在约25%的mRNA的3′-末端存在多个poly(A)位点. 在90%的mRNA前体的加尾信号下游都能检测到富含U/GU的调控元件, 尤其在以AAUAAA的多碱基变化序列作为加尾信号的mRNA前体中, 半数以上都能在poly(A)位点两侧检测到下游调控元件. 而且, 这些调控元件的位置对poly(A)位点的选择有限制作用. 总之, 虽然水稻mRNA加尾信号的保守性较低, 但大量下游调控元件的存在保证了多聚腺苷化过程的正常进行.     

阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理, 应用自杀性质粒pZJ25, 将Tn5转座到B8的染色体上, 筛选到2株拮抗活性丧失的菌株. 选择其中B8F突变株, 应用Tn5上的Kan^r基因作为标签, 对Tn5插入位点右侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆, 筛选得到质粒pTLF, 经亚克隆后测序, 获得F片段735 bp的序列. 提取原始菌株B8基因组DNA, 酶切后与PstⅠ接头连接, 应用接头引物和根据F片段设计的特异引物, 在F片段的左右两侧进行染色体步行, 获得了F片段(Tn5插入位点)左侧的1106 bp序列和F片段右侧的664 bp序列. 生物信息学分析显示, 获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF, 与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(基因GenBank登录号AY192157)有较高的同源性, 分别对应于admM, admN和admO共3个基因. 被Tn5插入破坏的ORF(命名为anrF基因)对应于admM (Polyketide 合酶基因), 插入位点位于终止密码前214 bp处. 由此证明, anrF基因与B8菌株的拮抗活性相关, 推测B8菌株产生的拮抗物质为andrimid.     

X染色体的一个新的STS的创建

构建人基因组分辨率为100kb的STS(Sequene tagged sites)是今后5年的目标之一,为此需要创建3万个STS.1989年Olson等人首次提出STS图谱分析的概念,认为STS图谱可以作为染色体的骨架图(framework map)的位标(landmark).STS是人基因组中长为数百bp的单拷贝序列,它们的核苷酸顺序是已知的,在染色体上的位置已确定,并可以用PCR方法在基因组其它序列存在的情况下进行检测.     

来自长穗偃麦草的抗小麦条锈病基因的定位

对一套小麦_长穗偃麦草二体代换系进行了条锈病抗性鉴定、抗性遗传和生化分析 .结果表明 ,长穗偃麦草携带有新的抗小麦条锈病基因 ,位于 3E染色体上 ,在小麦背景中呈显性遗传 ,暂定名为YrE .长穗偃麦草编码的酯酶_5结构基因位于 3E染色体上 ,暂命名为Est_E5 .F2 群体分析发现Est_E5与抗病基因YrE呈共分离 ,表明Est_E5是检测 3E染色体及其携带的抗条锈病基因较理想的生化标记位点 .单体代换系 3A/3E和 3D/3E中 3E染色体通过自交的传递率显著高于 3B/3E中 3E通过自交的传递率 ,可能与E基因组和小麦A ,B ,D基因组的遗传分化程度有关 .     

人核受体nr5a2(hb1f)基因组序列的生物信息学分析

在克隆了人核受体基因nr5a2(hb1f )的cDNA的基础上, 测定了该基因的全基因组序列. 采用生物信息学手段对nr5a2(hb1f )基因组序列进行了深入分析. 序列同源性比较及编码序列预测结果提示, 在测定的210 kb基因组序列中,特别是人nr5a2(hb1f )基因的内含子中可能还存在其他的编码信息. 通过比较基因组方法分析不同生物nr5a基因的结构, 发现各种生物nr5a基因的结构具有保守性, 并且在进化过程中有明显的基因重复现象. 对斑马鱼、小鼠和人nr5a2基因上游序列的比较, 显示这些生物nr5a2基因的启动子区域相当保守, 提示不同生物的nr5a2基因可能受到同一类转录因子的调控.     

从基于结构定义的序列模体识别蛋白质的超家族

以进化上相距较远的蛋白质酪氨酸磷酸酶Ⅰ和Ⅱ为例, 通过结构比较和基于结构的序列比对及共同保守区域残基替换模式的分析, 定义了基于结构的序列模体. 利用这种新的模体对SWISS-PROT和TrEMBL蛋白质序列库进行搜索, 可特异性地同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ, 其识别正确率可达98.4%. 而在此之前, 尚未见可同时识别磷酸酶Ⅰ和Ⅱ序列模体的报道.     

两个东亚钳蝎毒素非编码转录本: 蝎毒腺细胞存在NMD途径的证据

从中国东亚钳蝎（Buthus martensii Karsch,BmK)毒腺组织cDNA文库中分离到两个毒素基因的非编码转录本,命名为BaαTX15-SP和BmTXKβ-SP。核苷酸序列分析表明它们的5’端序列分别与BmαTX15和BmTXKβ毒素cDNA的5’UTR和上游ORF序列一致,下游则缺乏任何同源性。两个非编码转录本含有多个短的ORF（≤34aa),3‘端含有一个AATAAA加尾信号,距poly(A)尾14－18nt。基因组织结构分析表明,两个非编码转录本并非错误剪接的产物。研究结果为蝎毒腺细胞可能存在类似于哺乳动物和酵母的无义介导的mRNA降解途径提供了证据。     

运用cDNA缩减杂交法克隆水稻花粉发育有关的cDNA

花粉母细胞减数分裂期是花粉发育和形成的一个重要时期 .为了克隆此时期水稻花粉发育的基因 ,以可育系安农N及其温敏核雄性不育突变体安农S 1为材料 ,先抽提花粉母细胞减数分裂期幼穗的mRNA ,然后采用cDNA缩减杂交法 ,成功地克隆了RP 1 ,RP 2和RP 33个cDNA .Northern杂交分析表明 ,这 3个cDNA相对应的mRNA都只在花药中表达 ,而不在叶中表达 ,而且在安农S 1中的表达量 ,也明显低于在安农N中的表达量 .其次 ,在高温 (≥ 2 8℃ )下生长的安农S 1的表达量也明显低于在较低温 (≥ 2 5℃ )下生长的安农S 1 .经序列同源性分析 ,尚未发现与RP 1 ,RP 2和RP 3序列同源的基因 .以上结果显示这 3个是新的与水稻花粉发育有关的基因     

黄色黏细菌fruA mRNA 5''''非翻译区正性调节其自身基因的表达

黏细菌是研究多细胞结构形态发生机制的良好模型. FruA是黏细菌发育所必需的一种转录因子, 其mRNA 5'端存在相当长的由235个核苷酸组成的非翻译区(5'-UTR). 以lacZ为报告基因, 构建保留或缺失5'-UTR的fruA-lacZ翻译融合载体并在染色体attB位点定点整合. 5'-UTR自+4 ～ +220缺失后fruA-lacZ在发育阶段几乎不表达, 说明完整的5-'UTR为fruA表达所必需. 二级结构预测显示, 该区域可形成高度稳定的3螺旋接合结构, 可能是蛋白因子的结合位点或存在调节fruA表达的顺式元件. 因此, fruA发育特异性表达受其5'-UTR的正性调控.     

玉米C4 型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究

通过LA-PCR方法，从当地玉米材料中获得了完整的玉米C₄ 型pepc基因。测序结果与GenBank中登录的玉米C₄ 型pepc基因序列进行比对分析表明，DNA序列的同源性达98.96%，mRNA同源性达99.38%，蛋白质的氨基酸序列同源性达99.38%，在DNA水平，两者之间有49处碱基差异， 18处发生在内含子区，18处发生在外显子处。在mRNA水平，两者之间有15处差异，但是这些差异在蛋白质水平上仅导致了4个非连续排列的氨基酸差异。构建了该基因的农杆菌二元表达载体pBAC214。通过PDS/1000He基因枪转化法，获得了该基因的转基因小麦。对转基因小麦进行的Southern杂交，结果表明来自玉米的鉴定pepc基因完全整合到了小麦基因组中。通过对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析，表明该基因在小麦中获得了正确的转录、剪接和翻译。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3-5倍，与玉米叶片中的PEPC活性相当。对转基因小麦旗叶光和生理指标的测定，发现部分转基因植株光合速率有所提高，并且气孔的开放程度与叶片中的PEPC活性紧密相关。说明完整的玉米C₄ 型pepc基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。     

外源CAT mRNA在金鱼卵各发育阶段中的功能

过去实验把鲫鱼DNA注入金鱼卵中,发育出小鱼的尾鳍约有 1/4由金鱼的双尾型变为鲫鱼的叉型尾.用鲫鱼卵提出的mRNA注入金鱼卵,同样有1/3小鱼的双尾型变为鲫鱼的叉型尾.外源mRNA在受精卵中是如何改变遗传性的?我们认为,可以从两方面考虑:(1)mRNA翻译蛋白,在适当发育阶段激活染色体上基因;(2)金鱼卵内可能存在逆转录酶(RT),由它催化mRNA合成cDNA而发挥作用.注入卵内的mRNA能翻译蛋白,这已有报道,但