半胱氨酸蛋白酶基因RNA干扰表达载体的构建及油菜的遗传转化

将半胱氨酸蛋白酶基因(Bncp5)cDNA序列片段正反向插入表达载体pFGC5941中,构建了RNA干扰表达载体pFGC-Bncp5-RNAi.采用根癌农杆菌介导法,转化甘蓝型油菜下胚轴.在5mg/L BastaMS培养基中筛选,PCR鉴定结果显示,获得Bncp5转基因植株28株.半定量PCR分析结果显示,半胱氨酸蛋白酶基因在转基因油菜中表达受到一定程度的抑制,表明Bncp5的干扰载体在油菜中得到表达.     

水稻OsRhoGDI2基因RNA干扰载体的构建

水稻OsRhoGDI2是通过酵母双杂交筛选到的小G蛋白Rho家族成员OsRacD互作蛋白的编码基因,为了研究OsRhoGDI2与OsRacD的相互作用及其在水稻发育中的功能联系,本研究基于序列比对的提示,选择了OsRhoGDI2基因长度为285 bp的特异区段,分别以正向和反向插入中间载体pKANNIBAL中,并亚克隆...     

BnGID1基因干扰载体的构建和对甘蓝型油菜的转化

BnGID1基因是本实验室克隆到的AtGID1基因在甘蓝型油菜(Brassica nupus L.)中的同源基因.为了验证该基因在甘蓝型油菜中的功能,我们利用pFGC5941双元载体构建了BnGID1基因的干扰载体并将其转化入甘蓝型油菜野生型“3529”中,得到了BnGID1基因表达被部分抑制的转基因植株.性状观察证明,在BnGID1基因表达被部分抑制后,植株表现出明显的矮化特征,高度显著降低,叶片产生皱缩.与水稻,拟南芥中的GID1基因缺失突变体的性状比较证明BnGID1基因具有与OsGID1,AtG     

甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜BnBRI1基因过量表达载体pFGC5941-BnBRI1和RNA干扰载体pFGC5941-BnBRI1-Ri,以根癌农杆菌介导的方法转化甘蓝型油菜"W679"下胚轴外植体,经PCR鉴定,获得18株转基因阳性植株,其中1株为BnBRI1基因过量表达转基因植株,17株为BnBRI1基因RNA干扰转基因植株.经RT-PCR鉴定显示,在过表达转基因植株中BnBRI1基因表达量比野生型甘蓝型油菜高,而在RNA干扰转基因植株中表达量比野生型低,RNA干扰BnBRI1基因的表达导致了植株的矮化,矮化植株将可用于油菜株型的遗传改良,以培育适于机械化生产的中矮秆油菜新品种.     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.     

RNA干扰沉默PID1基因在C2C12细胞中表达的研究

 构建和筛选对PID1（phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1）基因有RNA干扰作用的PID1-shRNA表达载体。据小鼠PID1 cDNA序列,优化设计了4条shRNA及1条阴性干扰序列,插入pGPU6/GFP/Neo载体中,得到pGPU6/GFP/Neo-PID1-1、pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3、pGPU6/GFP/Neo PID1 4和pGPU6/GFP/Neo-PID1-NC。干扰载体转染C2C12细胞,以RT-PCR和Western blot技术检测shRNA对C2C12细胞中PID1 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明：靶向PID1基因的4个shRNA重组质粒载体经测序分析,其shRNA编码序列与预期设计的完全一致,经酶切鉴定和测序分析证实,靶向PID1基因的shRNA重组质粒载体构建成功。进一步将构建的4个表达载体分别转染C2C12细胞,24h后细胞中PID1基因mRNA表达水平依次下调 (23.58±1.87)%、(75.44±0.77)%、(70.52±0.41)% 和 (56.60±3.13)%。48 h后细胞中PID1蛋白表达水平依次降低 (30.15±5.05)%、(71.86±4.85)%、(67.93±2.28)% 和 (56.81±2.01)%。所筛选出的pGPU6/GFP/Neo-PID1-2、pGPU6/GFP/Neo-PID1-3和pGPU6/GFP/Neo-PID1-4三个表达载体均能高效地抑制转染细胞PID1 mRNA和蛋白的表达,为进一步研究PID1基因的功能奠定了基础。     

荧光定量PCR法在人类宫颈癌RNA干扰中的应用

研究荧光定量PCR法在RNA干扰（RNAi）技术抑制宫颈癌Caski细胞人乳头瘤病毒16型E6基因（HPV16E6）的应用情况,并与传统使用的灰度值分析法进行比较。构建shRNA重组质粒干扰载体转染至Caski细胞中。通过荧光定量PCR法和灰度值分析法检测干扰后细胞HPV16E6基因的mRNA及蛋白质表达水平。实验表明HPV16E6基因mRNA及蛋白质的表达量都有明显降低,与阴性对照空白质粒组相比有显著差异（P〈0．01）;RNAi对宫颈癌Caski细胞中HPV16E6基因的表达具有较高的抑制率;荧光定量PCR法较之传统的灰度值分析法更为准确。     

NS特异性干扰载体pGenesil-1-NS的构建及鉴定

目的核干细胞因子(nucleostemin,NS)是维持干细胞和癌细胞增殖所必需的蛋白质,可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点.本文旨在构建靶向NS干扰载体p Genesil-1-NS,为后续实验奠定基础.方法基于已发布的NS mRNA序列(NM_206825),选取5'-AAGCCTA GGAAAGACCCAGG-3'(397-416)作为候选靶序列,按shRNA载体设计原则,设计合成两条互补DNA链,退火后插入载体,并以酶切和测序鉴定重组转化子.结果经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体.结论成功构建NS特异性干扰载体p Genesil-1-NS,可用于NS在肿瘤中的功能研究.     

利用pGenesil-1.0构建人Dna2真核表达干扰载体

目的:构建人基因Dna2干扰(RNAi)的真核表达载体.方法:根据GenBank上人Dna2的cDNA序列设计并合成两条单链寡核苷酸,退火以后,插入质粒pGenesil-1.0多克隆位点的BamH I和Hind III之间进行重组,构建重组干扰载体,转化DH5α后测序鉴定出阳性菌株.重组质粒以脂质体法转染HeLa细胞,提取Dna2蛋白以免疫印迹法检验干扰效果.结果:设计的目的干扰序列5’-catagccagtagtattcgatg-3’可明显抑制Dna2在HeLa细胞的表达.结论:利用pGenesil-1.0构建的人Dna2干扰载体适用于该基因功能研究.     

日本三角涡虫Dj-β-catenin-1基因干扰载体的构建与干扰效果的鉴定

为了研究抑制Dj-β-catenin-1基因对涡虫再生的影响,构建了L4440-Dj-β-catenin-1干扰载体.将含有重组质粒L4440-Dj-β-catenin-1的HT115细菌经IPTG诱导后直接喂食涡虫.结果表明,Dj-β-catenin-1基因经RNA干扰后涡虫不能正常再生,面向后端伤口再生出一个头部而不是尾.此外,Dj-β-catenin-1基因的沉默还能使涡虫正常的尾转变成头.上述工作为进一步研究Dj-β-catenin-1基因在日本三角涡虫再生中的作用奠定良好基础.     

番茄CDT2同源基因RNA干涉载体的构建及遗传转化研究

真核生物CDT2是CUL4-DDB1 E3泛素复合体的组成部分,在细胞周期调控、DNA复制与损伤修复中起到重要作用.本研究克隆了番茄CDT2同源基因片段并构建了CDT2基因RNA干涉植物表达载体pBI121-CDT2-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株叶片内CDT2的表达量明显低于野生型植株.转基因植株叶片叶绿素含量比野生型明显升高.该研究结果揭示番茄CDT2基因的功能做出了新的尝试.     

利用RNAi技术鉴定哈茨木霉聚酮合酶基因pkst-1的功能

哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是优良的生物防治真菌,能产生抗生性聚酮化合物(polyketides).目前没有关于催化木霉聚酮化合物合成的聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)的相关编码基因的报道,这限制了对聚酮化合物代谢合成途径的研究.该研究通过融合PCR技术获得哈茨木霉的聚酮合成酶pkst-1基因的编码区序列,成功构建了RNAi介导的pkst-1基因沉默表达载体,使pkst-1基因的表达量在mRNA水平上显著降低.pkst-1基因失活使转化子发酵液产生了类似基因敲除的抑菌效果,降低了哈茨木霉抑菌能力,研究表明pkst-1基因编码催化抗生性聚酮化合物合成的关键酶.此外,RNA干扰技术在研究中的成功应用为哈茨木霉或其它丝状真菌的次级代谢合成途径相关基因的功能鉴定提供新的研究思路.     

沉默白细胞介素10基因对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的影响

为了研究藏猪免疫细胞中IL-10基因表达抑制后对RNA病毒感染及其免疫应答的影响,本实验构建和筛选了抑制猪IL-10基因表达的shRNA干扰分子及其表达载体,并以新型的壳聚糖接枝聚乙二醇和聚乙烯亚胺修饰分子(CS-N-PEI-PEG)通过离子交联法进行分子包装,制备DNA-壳聚糖纳米分子,体外转染藏猪免疫细胞,观察猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)诱导免疫细胞IL-10基因的表达及其增殖感染水平.实验结果表明:与未转染纳米分子或者纳米分子不表达shRNA的空白对照组相比较,shRNA实验组的IL-10基因表达在24～72h内明显抑制(P<0.05),免疫细胞中PRRSV的增殖水平显著下降(P<0.05);同时IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ基因的mRNA水平明显升高(P<0.05).这些提示IL-10的shRNA转染能使免疫细胞的抗感染能力显著增强,甚至可完全抑制PRRSV的复制.     

RNA干扰在肿瘤转移研究中的应用

RNA干扰是与特定基因同源互补的双链RNA在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默的过程。由于其在基因沉默中的高度特异性和有效性,在基因功能和基因药物的研究中有很大潜力。综述了RNA干扰可能的分子机制、分子生物特性和其在肿瘤特别是肿瘤转移中的应用。     

PCBP1基因RNAi序列的鉴定及其干扰效应的初步研究

以能与PCBP1mRNA特异结合的核苷酸片段(21个碱基对)构建shRNA真核表达载体并稳定转染Hela细胞,通过半定量RT-PCR、免疫印迹和间接免疫荧光实验证实转染细胞中PCBP1的mRNA水平和蛋白质表达水平均被显著抑制.接着,本研究通过测定稳定转染Hela细胞的生长曲线、血清依赖性生长曲线和软琼脂集落形成率,证明PCBP1的沉默能够显著抑制细胞的生长增殖能力以及克隆形成潜能,揭示PCBP1可能直接或间接参与细胞周期的调控.本研究成功鉴定了沉默PCBP1基因表达的有效干扰片段,为下一步利用该有效干扰片段进行体内研究奠定了基础.同时,本研究的结果将有助于深入认识PCBP1蛋白在细胞周期调控和细胞癌变中的作用机制.     

新型肠毒素蛋白SElK编码基因的克隆测序、生物信息学分析和表达载体构建

采用微波加热法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,根据NCBI上登录的肠毒素基因sek设计引物,PCR克隆selk基因,对selk基因测序并进行生物信息学分析,在此基础上构建重组表达质粒p ET-32a(+)-selk.测序结果表明本研究克隆得到具有正确编码序列的新型肠毒素selk基因;Protparam分析表明在一级结构水平上该蛋白具有较高的热稳定性;亲疏水性分析表明SEl K蛋白是一个亲水性较高的蛋白质;同源建模表明SEl K蛋白的domain B结构域缺乏传统肠毒素所具有的胱氨酸环,但SEl K蛋白domain B中β-折叠片数量比传统肠毒素更高.这些结果为进一步研究SEl K蛋白的结构与功能奠定基础.     

新型Bola两亲分子作为基因治疗药物输递载体的研究

为检测新型Bola两亲分子(Orn-C16-G)用作基因载体的性能,制备了Bola与siRNA的复合物(Bolaplexes),用原子力显微镜观察其在不同复合比下的形貌;并转染Hela细胞,用CCK-8检测Bolaplexes的细胞毒性,用荧光显微镜、流式细胞仪表征Bolaplexes的细胞内吞效果。实验结果显示,复合比1∶1条件下,Bola分子可以有效地压缩siRNA分子形成较小尺寸的复合物(100～200 nm)。Bolaplexes可高效地进入Hela细胞,并且毒性低于商售转染试剂,有较好的应用前景。本研究为下一步Bola两亲分子用于基因治疗的临床研究奠定了基础。     

水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建

Whirly蛋白是一种单链DNA结合蛋白,是植物特有的存在于细胞核与叶绿体中的双定位蛋白.本研究以水稻品系金23B为材料,从cDNA中克隆得到水稻whirly蛋白基因(OsWHY1).该基因的c DNA全长为1 250 bp,开放阅读框大小为825 bp,编码274个氨基酸.结构域分析结果表明OsWHY1蛋白序列具有whirly蛋白家族共有的whirly结构域.蛋白质序列比对分析表明,OsWHY1蛋白序列与玉米(Zea mays),小米(Setaria italica),黍(Panicum miliaceum),高粱(Sorghum bicolor),大麦(Hordeum vulgare)的蛋白序列相似性分别为79. 8%、83. 1%、82. 7%、78. 7%和75. 3%.此外,本研究通过酶切酶连的方法成功构建了pU1300-OsWHY1过表达载体和PTCK303-OsWHY1 RNA干扰载体,为进一步研究OsWHY1基因在水稻持绿性中的功能打下基础.