携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对犬心肌缺血的基因治疗

为了进一步研究重组腺病毒Ad-HGF对心肌缺血的治疗效果及其安全性, 在体外实验和大鼠实验的基础上制作了犬心肌缺血的模型, 从3个方面评价Ad-HGF对心肌缺血的治疗效果. 首先, 通过冠状动脉造影观察侧支循环形成的情况, 发现治疗组动物的侧支循环比对照组丰富; 然后, 对心脏切片进行TTC染色, 并通过图像分析确定缺血区面积, 结果显示治疗组动物的缺血区明显小于对照组; 最后, 从心肌中回收彩色微球计算局部心肌血流量, 结果显示治疗组动物的局部心肌血流量基本恢复到了结扎前的水平. 另外, 在长期毒性研究中,用中和方法检测了腺病毒抗体产生的情况, 发现腺病毒抗体在第4次注射后产生, 达到高峰后缓慢下降, 于停药12周后消失. 总之, Ad-HGF对心肌缺血的治疗是有效的, 同时也会诱导机体产生抗体中和体内的腺病毒, 这可能是腺病毒载体的清除机制.     

一种新型的低辅毒污染的重组AAV生产系统

将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中, 用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒. 在大量生产带有目的基因(EGFP, hFⅨ )的重组腺相关病毒载体的同时, 最大程度地限制了辅助病毒的产生, 从而减轻了下游纯化工作的压力. 活体动物实验的结果证实了这种方法的优越性. 实验结果为重组AAV载体系统在基因治疗领域中的应用提供了一条新的途径.     

转基因肝星状细胞定向诱导骨髓Thy-1^＋β2M^-1细胞向肝细胞分化

体内移植研究表明，骨髓来源的干细胞具有向成熟的肝细胞分化的能力。然而，成体干细胞向肝细胞诱导分化的效率、分化细胞的功能状态、微环境对细胞分化的影响等均存在许多疑问．以高效、稳定表达肝细胞生长因子的肝星状细胞株CFSC／HGF作为饲养细胞，成功地将大鼠骨髓来源的Thy-1^ β2M^-1细胞(bone marrow derivedThy-1^ β2M^-1 ceils，BDTCs)诱导为肝细胞，经RT-PCR和免疫荧光化学检测证实，该条件下诱导后的BDTCs表达幼稚或成熟肝细胞特异性的基因，分化细胞具有成熟肝细胞特有的靛青绿摄取排泌、氨基代谢和白蛋白分泌的功能，提示肝细胞生长因子、肝脏非实质细胞及其产生的细胞外基质为骨髓干细胞向肝细胞分化提供了适宜的微环境。这为以骨髓干细胞为基础的再生医学在终末期肝病治疗中的应用提供了理论和技术上的支持。     

肌肉电针介导VEGF基因治疗大鼠闭塞性血管病

应用电针介导血管内皮生长因子 (VEGF)基因治疗实验性外周血管闭塞症大鼠 ,以RT PCR及免疫组化方法观察VEGF基因的表达 ,通过血管造影技术观察VEGF基因导入大鼠体内后的生物效应 .结果显示 ,电针介导VEGF基因可在大鼠肌肉组织高效表达VEGF ,并可促进局部组织新生血管形成和侧枝循环建立 ,使血流恢复 ,为闭塞性血管病的基因治疗提供一种新的基因转移方法 .     

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒.     

肌肉电针介导VEGF基因治疗大鼠闭塞性血管病

应用电针介导血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因治疗实验性外周血管闭塞症大鼠,以ＲＴ－ＰＣＲ及免疫组化方法观察ＶＥＧＦ基因的表达,通过血管造影技术观察ＶＥＧＦ基因导入大鼠体内后的生物效应。     

编码蚯蚓纤溶酶组分A基因的cDNA克隆及表达

蚯蚓纤溶酶组分A是赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内纤溶酶的主要组分之一，具有双重纤溶活性，用逆转录PCR(RT—PCR)的方法从赤子爱胜蚓中克隆了编码蚯蚓纤溶酶组分A的cDNA，由其推测的氨基酸序列与丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶家族的成员具有较高的同源性，而且具有其保守的催化位点，表明该蛋白质可能是胰蛋白酶家族的成员．将上述cDNA导入大肠杆菌的表达载体pQE31和pMAL—c2X，构建表达质粒pQE—efea和pMAL—efea，这2个表达质粒均可以在大肠杆菌苗株M15中诱导表达出与预期大小相近的重组蛋白。其中，pQE—efea表达的His6—EFEa主要以包涵体形式存在，而pMAL—efea表达的重组蛋白MBP—EFEa是可溶性的，并且具有纤溶活性。     

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMVΔR8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒. 重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达. 重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/10⁶细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低. 将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d. 上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.     

癌症的靶向基因-病毒治疗

肿瘤的单纯基因治疗或单纯肿瘤特异性增殖病毒治疗,都取得了一定的疗效,但都无重大突破.本文提出一种癌症的靶向基因-病毒治疗新策略(targeting gene-virotherapy of cancer),即将基因治疗与病毒治疗各自的优点结合起来,取得的疗效比上述任何单一的治疗都好.实验所用的载体是改造过的腺病毒ZD55或hTERT-Adv,但单用一个基因还不足以完全消灭实验动物的肿瘤,因此进一步采用双基因治疗方案,即targeting dual gene-virotherapy of cancer.如果两个基因选择恰当,当它们有协同效应或互补作用时,如Trail与K5,Trail与Smac,则基本可以全部消灭实验动物所荷肿瘤.此外,要取得癌症治疗的好结果,靶向性也很重要,故一种新的双靶向病毒调控-双基因的癌症治疗策略被创造出来,并取得了很好的效果,申请了专利.无肠腺病毒为第三代腺病毒载体,它容量大,可克隆入很大的基因,又无免疫原性,可长期使用,如将前面各种良好肿瘤治疗策略结合运用到无肠腺病毒载体中,一定会构建出最好的肿瘤治疗方案,会使肿瘤治疗取得极好的效果.     

人凝血因子Ⅸ cDNA在血友病B患者骨髓基质细胞中的高效表达

1987年Anson等首次将入FIX cDNA成功地转移到中国仓鼠卵巢细胞中,并提出了基因治疗血友病B的设想.近年来,FIX cDNA已先后在皮肤成纤维细胞、成肌细胞、肝细胞、内皮细胞和角质细胞中得到不同程度的表达(表1),其中,薛京伦等进行的经皮肤成纤维细胞途径的血友病B基因治疗临床试验已取得了安全有效的结果.为进一步提高FIX的表达水平,探索新的靶细胞,我们率先以血友病B患者骨髓基质细胞(BMS)为靶细胞,将新构建的安全型反转录病毒载体LNCIX通过反转录病毒介导基因转移到BMS细胞中,基因修饰的     

GDMF工程细胞对多巴胺能神经元的保护

体内和体外实验均证明胶质细胞源性的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)对多巴胺(DA)能神经元有较好的保护作用,为治疗帕金森氏病提供了启示.但这些证据均来自应用GDNF蛋白进行的实验,而GDNF蛋白不能通过血脑屏障,不利于临床应用,若能把携带GDNF基因的工程细胞移植入脑内,使其稳定高效地表达,则对帕金森氏病的防治将有积极意义.本研究把携带GDNF cDNA的重组质粒转入NIH 3T3细胞系,筛出稳定表达的克隆,与SD大鼠原代多巴胺能神经元共培养,观察到明显的保护作用,为用Ex Vivo法治疗帕金森氏病奠定了基础.     

腺病毒E1和E4区基因共存的细胞系的建立

腺病毒载体相对安全,能有效地将外源基因转导到培养细胞或动物细胞中,但仍存在装载容量不够理想和免疫原性两个缺点.尤其是后一缺点,已成为制约其应用于临床基因治疗的主要因素.据认为,E4区基因在免疫原性中起着关键作用.因此人们希望通过发展E4区和Ela共缺陷的腺病毒载体,以降低或消除腺病毒载体免疫原性.这首先需要建立E4和E1区共存的包装细胞系,以互补腺病毒载体上E4和E1区功能的缺失,完成腺病毒载体的复制和包装.但有文献认为E4区和E1a不能稳定地存在于同一细胞中.我们成功地将腺病毒的E4区(pJM17的9724bp EcoRⅠ—XbaⅠ片段)插入AAV(Adeno-associated virus,腺辅助病毒)载体pAAV/neo中,并转导进293细胞(来自腺病毒E1区转化的人胚肾细胞,含有E1a区)中,得到了E1和E4区稳定共存的G418抗性细胞系.结果说明,E1和E4区可以稳定地共存于同一细胞,有可能建立无或低免疫原性,外源基因装载量由8kb扩大到17kb的新一代腺病毒载体系统.另外也表明,AAV载体介导的外源基因大小至少可达12kb左右(E4区9.7kb neo基因2.7kb=12.4kb).     

转基因肝星状细胞定向诱导骨髓Thy-1+β2M-细胞向肝细胞分化

体内移植研究表明, 骨髓来源的干细胞具有向成熟的肝细胞分化的能力. 然而, 成体干细胞向肝细胞诱导分化的效率、分化细胞的功能状态、微环境对细胞分化的影响等均存在许多疑问. 以高效、稳定表达肝细胞生长因子的肝星状细胞株CFSC/HGF作为饲养细胞, 成功地将大鼠骨髓来源的Thy-1⁺β₂M^-细胞(bone marrow derived Thy-1⁺β₂M^-cells, BDTCs)诱导为肝细胞, 经RT-PCR和免疫荧光化学检测证实, 该条件下诱导后的BDTCs表达幼稚或成熟肝细胞特异性的基因, 分化细胞具有成熟肝细胞特有的靛青绿摄取排泌、氨基代谢和白蛋白分泌的功能, 提示肝细胞生长因子、肝脏非实质细胞及其产生的细胞外基质为骨髓干细胞向肝细胞分化提供了适宜的微环境. 这为以骨髓干细胞为基础的再生医学在终末期肝病治疗中的应用提供了理论和技术上的支持.     

大豆转录因子GmWRKY57B的基因克隆及功能分析

WRKY类转录调控因子在高等植物中构成一个基因超家族, 它不但广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应, 还参与了生长发育及多种代谢途径的调控. 本研究构建了一个大豆cDNA文库, 采用酵母单杂交的方法, 用来自AtNPR1启动子区的W-box对构建的大豆cDNA文库进行筛选, 获得了GmWRKY57B基因, 该基因全长1033 bp, 编码299个氨基酸, 属于WRKY类转录因子的第Ⅲ组; 酵母挽救实验及凝胶阻滞实验均表明, GmWRKY57B能够与W-box特异性结合; 酵母体内的转录激活实验表明, GmWRKY57B在酵母细胞中具有转录激活功能; GmWRKY57B在大豆根、茎、叶中均有表达; GmWRKY57B基因在烟草中的过表达能够提高转基因烟草植株的抗旱性, 表明GmWRKY57B 基因在非生物逆境中有一定的功能.     

利用EBV穿梭质粒表达人凝血Ⅸ因子的初步研究

目前开展的遗传病基因治疗研究大多是先取患者体细胞体外培养,通过反转录病毒感染使正常基因cDNA整合于基因组中,选择克隆、扩增,再将细胞植回病人体内.但有以下问题:(1)细胞表达水平的高低很大程度取决于基因的整合位置,各克隆的表达相差悬殊,虽可通过挑克隆解决这一问题,但挑克隆工作量大,且克隆细胞如传代次数过多亦不利于其表达.(2)病毒载体通常只带一份拷贝进入细胞,转基因产物的表达量不高,这样植回病人体内的细胞就需     

腺病毒5型E1A在毕赤酵母中的表达及对肿瘤细胞生长的抑制作用

腺病毒5型E1A(Ad5E1A)作为一个抑癌基因, 由于具有较强抑癌作用及显著的化放疗增敏作用而受到人们的关注. 但由于它能整合到宿主细胞基因组中长期表达, 并能使Rb基因失活, 使动物细胞永生化等而引起人们的担心. 为了避免E1A在基因治疗中存在的问题, 设想以E1A蛋白进行探索. 首先构建了E1A真核表达载体(pPIC9/E1A), 转化毕赤酵母(GS115), 筛选高表达重组菌株. 经摇瓶试验, 甲醇诱导表达3 d后, 分泌型的E1A蛋白经HiTrap Q 和HiTrap SP两步柱层析, 获得了较高纯度的E1A蛋白, 并经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定. E1A蛋白经Chariot介导能顺利进入细胞, 并大部分定位在细胞核, 使LN686细胞发生明显的G2/M期阻滞, 体外能显著抑制LN686肿瘤细胞生长. 为利用E1A蛋白在肿瘤治疗中应用的可能性提供了实验依据.     

表皮生长因子及其受体在大鼠肝癌细胞的免疫细胞化学定位

表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是一种含53个氨基酸残基的多肽,分子量6.045ku。已知EGF可促使新生大鼠肝细胞的分裂,并刺激肝细胞DNA的合成。在这些肝细胞的表面已证明具有EGF的受体,Mullhaupt等证明肝有EGF的RNA表达。但至今为止有关EGF在肝癌细胞的定位尚未见报道。Gusterson等发现EGF受体在人肝癌细胞的分布,但对EGF受体在癌细胞的具体定位无详细描述。本研究以培养的大鼠肝癌细胞系为研究对象。采用免疫细胞化学方法观察了EGF及其受体在肝癌细胞的分布,为进一步研究EGF在肝癌细胞中的意义提供形态学依据。     

人可溶性TRAIL蛋白在衣藻叶绿体中的表达

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性. 以衣藻叶绿体基因组的clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2为同源重组片段, 壮观霉素抗性基因为选择标记, 构建了编码TRAIL胞外区可溶性片段(sTRAIL)的cDNA衣藻叶绿体表达载体p64TRAIL, 通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中, 经壮观霉素抗性筛选, 获得了3个抗性衣藻转化子. 转化子经过抗性继代筛选后, 经PCR, Southern blot检测分析及暗培养, 证实sTRAIL编码区DNA已整合到衣藻叶绿体基因组中, Western blot检测分析表明, sTRAIL编码区在衣藻叶绿体中获得了表达. Western blot影像摄录分析表明, 表达的sTRAIL蛋白占衣藻细胞可溶性总蛋白的0.43%~0.67%. 实验结果证明, 用衣藻叶绿体作为生物反应器生产医药蛋白是可行的.     

人视神经瘤和胶质瘤细胞系的睫状神经营养因子表达和克隆

睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)是第一个被发现可促进离体和在体运动神经元存活、对神经系统正常发育和受损神经的再生修复有重要作用的神经因子,主要存在于星形胶质细胞和施旺细胞.人CNTF基因定位于11号染色体长臂的近例端,其基因结构不与神经营养素家族同源也不含信号肽.我们发现大鼠坐骨神经再生过程中CNTF的基因表达下调,提示它的表达量与损伤后胶质细胞的增殖未必匹配.国外已重组了人CNTF,国内尚未见报道.由于我们没有人系统神经的cDNA文库,故用大鼠CNTFcDNA探针来检测人视神经胶质细胞瘤和人脑胶质母细胞瘤细胞系中是否有人CNTF的表达,再用反转录PCR克隆出人CNTF cDNA,目的是获得重组的人CNTF蛋白.     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒全长可读框的表达及其产物免疫原性分析

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)全长约为6.9 kb的可读框(ORF)克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中, 构建重组家蚕杆状病毒转移质粒pVL-ORF. pVL-ORF与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 经空斑筛选后成功获得携带有FMDV全长ORF的重组病毒Bm-ORF. 免疫荧光技术证明, 重组病毒能够正确表达插入的外源基因. 将获得的重组病毒Bm-ORF感染家蚕5龄起幼虫, 双抗体夹心ELISA法和电子显微镜观察证明, 目的基因在蚕体中获得较高水平表达并组装成空衣壳. 用蚕表达产物作抗原制备疫苗免疫牛, 免疫动物均产生了特异性抗体. 免疫后21 d进行病毒攻击保护实验, 获得了2/4的完全保护.