密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

为了提高流感病毒血凝素（HA）基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A／Goose／HLJ／QFY／04（H5N1）流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI—neo中,构建了真核表达质粒pCI—opti—HA．将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI—wt—HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和蛋白免疫印迹（WB）实验比较HA蛋白的表达量．将两种重组质粒免疫Balb／c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平．三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果．IP—MA和WWWB实验结果表明：密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高．酶联免疫吸附实验（ELISA）结果表明：小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高．攻毒试验结果表明：两种重组质粒均能够提供较好的保护．     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(52 bp～1 549 bp)、pMET A/NA(121 bp～1 260 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗开发等进一步研究奠定了基础。     

弓形虫SAG1,ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究

目的 检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果.方法 将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体,构建重组质粒;RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达;通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫;腹腔内注射毒性株弓形虫速殖子攻击免疫小鼠.结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达;SAG1和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫,对于毒性株弓形虫感染攻击具有保护作用.结论 不同候选抗原编码基因重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示含有多种成分的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一.     

GST-UCP2-N和GST-UCP2-C原核表达载体的构建表达及多克隆抗体的制备

以pMD18-T-hucp2为模板,用设计的两对特异性的引物PCR得到hucp2cDNA N端和C端的两断基因片段,然后将其插入到pGEX-5X-1表达载体上,重组质粒在PCR、双酶切、测序鉴定后,经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21表达大量融合蛋白GST-UCP2-N(C),经GST亲和层析纯化蛋白.以该蛋白为抗原免疫ucp2基因敲除小鼠,western blot鉴定血清中抗体的反应性.实验证明成功构建了构建pGEX-5X-1-UCP-N(C)重组质粒,表达出了融合蛋白.并获得了抗血清.为进一步获得灵敏性更高,特异性更强的UCP2的抗体打下了基础.     

HIV-1C亚型DNA疫苗诱导小鼠免疫反应的研究

 构建含中国流行株HIV-1 C亚型核心蛋白gag基因的重组质粒pVAX-gag,并在体外进行了表达与鉴定.同时构建了含此gag基因的原核表达质粒pGEX-gag,表达纯化并鉴定重组蛋白Gag.以质粒pVAX-gag免疫Balb/C小鼠后,用ELISpot和流式细胞仪检测其细胞免疫反应.再以纯化后的重组蛋白Gag作为包被抗原,用ELISA检测其体液免疫反应.结果显示重组质粒pVAX-gag免疫小鼠后可有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,且免疫剂量和免疫效果存在一定的正相关性.重组原核表达质粒pGEX-gag的表达产物能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应,可用于抗HIV抗体检测.     

禽流感病毒HSNl血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达毒

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒HSNI血凝素基因(hemaggludnin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA) 序列,为制备抗体和基因T程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5NI全长HA、NA基因并测序的基础 上。将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A／HA(49一l 587 bp)、pMET A／NA (121—1 200 bp),电转化真核酵母菌pMADl6,甲醇诱导表达,利用Ni“亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用 Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS—PAGE显示蛋白表 达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95％以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原 性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5NI HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的 开发等进一步的研究提供了依据。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA（49～1 587 bp）、pMET A/NA（121～1 200 bp）,电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

重组猪生长激素抗体的制备与纯化

为了获得重组猪生长激素抗体,对重组猪生长激素融合基因的真核表达产物进行免疫印迹(Western blot)检测,将利用DNA重组技术构建的重组质粒pPGH020在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行诱导表达.表达产物经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化的重组猪生长激素融合蛋白.然后以此为抗原免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体,抗体再经硫铵沉淀、透析和亲和层析纯化.Western印迹结果表明,该纯化抗体显示了良好的免疫反应,其灵敏度比兔抗rpGH抗血清提高50倍,为猪生长激素融合基因在真核细胞的表达及功能鉴定奠定了基础.     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建与表达

人心肌肌钙蛋白Ⅰ(hcTnI)是临床检测心肌损伤及预后提供诊断的生物学指标,由于来源有限,采用基因重组技术,以期获得高表达量的人心肌肌钙蛋白Ⅰ.人工合成hcTnI基因,将其插入pET-11a载体中,通过酶切鉴定正确后转入表达宿主菌BL21(DE3)中,诱导表达目的蛋白.采用蛋白免疫印迹反应(Western Blot,WB)鉴定表达目的蛋白的免疫特异性.经SDS-PAGE证实重组蛋白的相对分子质量约为2.6×104,凝胶密度扫描软件检测到目的蛋白占总蛋白比例为30.1%,WB实验验证诱导后目的蛋白特异性良好.成功构建了重组hcTnI基因在大肠杆菌表达的工程菌株,并获得表达,为制备高特异性的抗体及临床检测应用和测定标准化奠定了基础.     

重组人胰岛素原在大肠杆菌中的可溶性表达

目前重组胰岛素主要用于糖尿病的治疗.通过大肠杆菌(E.coli)密码子优化,设计人胰岛素原基因,建立利用大肠杆菌表达可溶性重组胰岛素原的技术方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组质粒p His-Nus Ainsulin诱导表达的大肠杆菌可溶性表达融合蛋白His-Nus A-insulin.重组蛋白His-Nus A-insulin可溶性表达的最适条件为0.1,mmol/L IPTG作用下37,℃诱导4,h,重组蛋白产物经过Ni柱纯化、500,mmol/L咪唑洗脱,得到纯度较高的1.059,μg/μL的重组蛋白His-Nus A-insulin,重组蛋白His-Nus A-insulin经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切作用后,获得可溶的人胰岛素原.     

顶头孢霉cefG基因的表达及抗体制备的研究

通过PCR方法得到带酶切位点的cefG基因,用于构建表达质粒pET30-G,并在大肠杆菌里成功表达出乙酰转移酶的包涵体。将该重组蛋白的标准品作为抗原,免疫BALB/c小鼠得到多克隆抗体,酶联免疫吸附测定(ELISA)分析得抗体的效价满足实验需求。利用该抗体绘制出抗原浓度的标准曲线,确定待测抗原适合的检测浓度在0.16μg/mL以下。制得的抗体在重组大肠杆菌里检测到了乙酰转移酶,证明所得抗体具有实验价值。     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

gfp融合的甲基对硫磷水解酶基因mph在E. coli中的表达

依照大肠杆菌密码子的偏爱性将来源于Pseudomonas sp. M6的有机磷水解酶基因mph设计合成了新的有机磷水解酶基因,然后将其与GFP融合进行表达,构建一株具有全细胞催化活性的大肠杆菌工程菌.设计优化后所合成的mph-r基因全长927 bp,然后将基因克隆到p ET23a-gfp大肠杆菌表达型质粒上,成功构建了重组表达质粒p ET23a-gfpmph-r,转化大肠杆菌感受态Rosetta blue.经过诱导剂IPTG的低温诱导24 h后,收集细胞,通过SDS-PAGE和Western Blot检测融合蛋白的表达.实验结果显示,融合蛋白的表达量大大提高,且通过酶活分析测定,全细胞酶活达到了11. 2 U/m L.     

H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫/杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

长爪沙鼠CST3序列同源性分析及蛋白体外表达

目的 分析长爪沙鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C,CST3)cDNA序列同源性,并建立CST3蛋白原核表达体系,为长爪沙鼠CST3抗体制备和后续基因功能研究奠定基础。方法 对长爪沙鼠Cst3 cDNA序列进行克隆、同源性分析及密码子优化;将优化后序列酶切连接到pET28a载体,完成重组CST3蛋白表达载体构建;将该载体转化到感受态细胞中,通过异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导实现CST3蛋白的原核表达,并用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证。结果 长爪沙鼠Cst3基因与人和小鼠Cst3基因的序列同源性较低。密码子优化后的长爪沙鼠Cst3表达序列插入到pET28a质粒中,获得了CST3蛋白表达载体。经1 mmol/L IPTG 37 ℃诱导12 h,可获得大量CST3蛋白。结论 成功地构建了长爪沙鼠CST3蛋白的体外表达体系。     

人和小鼠白细胞介素-5重组蛋白疫苗的提取

利用PCR技术从含有人和小鼠IL-5基因的质粒pORF9-hIL-5和pORF9-mIL-5质粒中扩增出人和小鼠IL-5基因序列,然后利用基因工程技术将人和小鼠IL-5基因序列分别插入原核表达质粒pQE30,获得人和小鼠IL-5重组表达质粒pQE-hIL-5和pQE-mIL-5.用酶切和DNA序列测定方法证实pQE-hIL-5和pQE-mIL-5正确后,转化感受态大肠杆菌JM109.用IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定.结果表明:琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的人和小鼠IL-5基因序列相对分子质量大小和预期值一致,酶切pQE-hIL-5和pQE-mIL-5片段和预期值相符,DNA序列测定插入的人和小鼠IL-5 PCR产物基因序列和阅读框架正确无误.重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白相对分子质量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达93%以上,抗组氨酸抗体可特异性识别hIL-5和mIL-5重组蛋白.     

结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849免疫学特性的初步检测

探讨了结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849作为药泵蛋白的转运功能及其作为外源蛋白免疫诱导C57BL/6小鼠产生免疫应答的能力.从H37Rv基因组中扩增获得Rv0849基因,酶切后连接到分枝杆菌穿梭质粒pMV261上构建重组质粒pMV0849,并以耻垢分枝杆菌为载体构建获得重组菌株SM(0849).检测药物对重组菌株SM(0849)的最小抑菌浓度(MIC)变化,用重组菌株免疫C57BL/6小鼠检测其作为外源蛋白免疫诱导小鼠产生的免疫应答反应.结果表明,重组菌株SM(0849)对药物的耐受性没有明显提高,但能够较早、较好地诱导小鼠体液免疫应答水平,并能通过刺激小鼠脾脏淋巴细胞促使其分泌高水平的肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ.Rv0849所编码的蛋白具有较弱的药泵功能,但有潜力成为一种新的免疫抗原.     

基因免疫研究进展

1990年WolffJA等意外发现小鼠骨骼肌细胞能直接摄取病毒裸露的DNA ,并表达其编码的蛋白质 ,这种表达可持续数月 ,这一发现为开创基因疫苗的研究奠定了基础。 1992年Tang等将带有人生长激素的质粒DNA通过基因枪导入小鼠表皮细胞 ,几周后 88%被接种的小鼠产生了特异性抗体。 1993年Ulmer等发现小鼠肌肉注射编码甲型流感病毒相对保守的核心蛋白的质粒载体后 ,可有效的保护小鼠抵抗另一亚型流感病毒的攻击 ,从而证明了注射不但能在体内表达抗原蛋白 ,并且可以诱导产生具有显著保护作用的免疫应答。从此继全菌弱毒苗和亚单位疫苗后 ,出现了…