人GABRA1实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

根据GenBank上人GABRA1基因的序列,设计并合成特异性的引物及探针,采用TaqMan探针法建立了荧光定量PCR法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线．结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12．07-32．72,相关系数为0．999,扩增效率为96．4%.建立的GABRA1TaqMan探针实时荧光定量方法具有线性范围广、扩增效率高、检测时间短、敏感性高等特点．     

荧光实时定量PCR检测紫花苜蓿DREB基因的方法

建立一种简便、快速、有效的检测紫花苜蓿DREB基因表达水平的荧光实时定量PCR方法.优化检测DREB基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测体系.运用建立的优化体系检测了低温处理后紫花苜蓿DREB基因表达情况.     

仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4．5mmol／L,400nmol／L和500nmol／L．同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100％,CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测,结果全为阴性．试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术,并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物,将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度,利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好,与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系,方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰;该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比,热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展

实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,已成为分子生物学和其它领域的重要技术工具。本文对实时荧光定量PCR技术的原理及其在食品、医学、环保领域的应用进行综述。     

应用实时荧光定量PCR检测外源基因拷贝数的新方法

介绍一种采用实时荧光定量PCR法鉴定重组细胞株基因组中外源基因拷贝数的方法.首先根据研究对象建立标准品,以拟检测的外源基因设计特定的引物,得出标准曲线,然后在不同重组细胞株中对外源基因进行Real-Time PCR鉴定,根据结果与标准品比对得出实际的拷贝数.结果表明:以转染sPDGFRα基因的重组CHO-K1细胞为例,采用该方法,利用标准品制备的标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系,并且具有较大的线性范围(101-105拷贝);测得各重组细胞株外源基因拷贝数不同,3次独立实验表明结果一致.与传统杂交技术鉴定转基因拷贝数相比,该方法具有高效省时、更稳定、高通量和低成本等优点.     

中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR方法的建立和优化

根据GenBank中卤虫actin基因的保守区域序列设计井合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ作为染料建立了实时荧光定量PCR（real—time fluorescence quanfitative PCR）方法．以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,其相关系数达到了0．999．溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰,Tm为83.6℃,结果表明：本实验建立的中国卤虫actin基因的实时荧光定量PCR法扩增效率高、特异性强、线性范围广、检测周期短,为actin基因作为内参基因进行卤虫早期胚胎发育基因表达的定量分析奠定了基础．     

猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中编码猫杯状病毒（FCV）衣壳蛋白ORF2的保守序列, 设计并合成了一对引物和相应的TaqMan探针, 建立了快速检测FCV的荧光定量PCR
方法. 通过对该方法的反应体系和反应条件进行优化, 建立了标准曲线, 给出了特异性、 敏感性和重复性实验, 并对临床24份疑似样品（其中阳性3份、 阴性21份）进行检测.  结果表明: 该方法检测cDNA的线性关系为0.992, 线性范围为2.26×10¹¹~2.26×10¹拷贝/μL; 可检测出样品中的FCV, 其他猫相关病毒检测为阴性; 批内重复性实验变异系数为2.158%, 与病毒分离结果相符.     

尼罗罗非鱼Hepcidin基因结构与序列分析

Hepcidins是一类具有调节铁代谢功能的抗菌肽.利用RT-PCR、RACE和LA等技术,以尼罗罗非鱼[Oreochro-mis niloticus(Linnaens)]肝脏中分离和克隆到Hepcidin基因.其全长cDNA为505 bp(不包括polyA),5′端非翻译区有85 bp,3′非编码区为156 bp,阅读框为264 bp.其编码的氨基酸包括信号肽和前体肽等,前体肽进一步酶解产生22个氨基酸的活性肽,该活性肽具有Hepcidin基因家族特有8个半胱氨酸的保守序列.罗非鱼的Hepcidin基因结构包含3个外显子和2个内含子.本研究为今后阐明Hepcidin基因表达特性、表达产物理化性质、抗菌活性及其相关功能等奠定基础.     

尼罗罗非鱼IgT重链的蛋白表达及表达分析

IgT（Immunoglobulin T）作为新型免疫球蛋白在粘膜免疫中具有重要作用. 文中根据尼罗罗非鱼IgT基因序列构建原核表达载体获得IgT重组蛋白,相对分子量约75 kDa,并制备出效价较高的小鼠抗罗非鱼IgT的多克隆抗体. 荧光定量PCR检测证明：健康尼罗罗非鱼中IgT在多种组织中都有表达,其中脾脏、皮肤、肠和鳃中表达量相对较高. 无乳链球菌感染后,皮肤和头肾中IgT mRNA的相对表达量分别在12 h和4 d显著上调. 免疫组化结果显示：IgT蛋白在头肾和皮肤中均有少量分布,在无乳链球菌刺激后,在皮肤中出现大量分布. 以上结果表明:IgT在尼罗罗非鱼皮肤粘膜免疫中具有重要作用.     

吉富罗非鱼不同家系的生长性状差异

以吉富品系尼罗罗非鱼为亲本,采用巢式配对法进行同质随机配对,配对252个家系,繁育获得106个家系,成功率为42.06％;通过标准化培育,构建了86个吉富罗非鱼全同胞家系和10个半同胞家系.选取22个不同家系进行同步的生长比较研究,结果表明:40、90、120及150日龄不同家系间平均体长、平均体质量的差异显著(P＜0...     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

近交培育五指山小型猪GHR基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的探讨近交培育五指山猪矮小的分子机理,为五指山猪实验动物化奠定基础。方法近交系五指山猪肝脏组织提取总RNA,然后RT-PCR成功扩增出GHR基因,克隆入pGEM-Teasy载体进行测序,并与正常猪GHR基因序列进行比对;然后经SalⅠ和XbaⅠ双酶切回收后与同样经过双酶切回收的pEGFP-C1真核表达载体连接,构建五指山猪GHR基因真核表达载体。结果测序结果表明:五指山猪GHR基因编码区包括639个氨基酸;经过酶切和测序验证五指山猪GHR基因真核表达载体构建成功。结论经序列比对后发现GHR信号肽编码区发生两处氨基酸替换,可能会影响到生长激素的胞内运输;生长激素受体胞内域编码区发生多处突变,并且导致相应氨基酸发生替换,可能会影响生长激素受体的下游信号转导。五指山猪GHR基因真核表达载体的成功构建为进一步研究GHR的功能和下游信号转导奠定了基础。     

饲料磷和维生素D3含量对尼罗罗非鱼磷收支的影响

本研究用鸡卵蛋白、糊精、纤维素、淀粉等原料,以NaH2PO4为唯一磷源,通过调节日粮磷和维生素D3的水平设置8种精制饲料,研究了饲料中的P和维生素D3含量对尼罗罗非鱼生长以及磷收支的影响.结果表明:(1)尼罗罗非鱼对P的最适需要的质量分数为7%,对维生素D3的最适需要量为104 IU/kg 左右;(2)尼罗罗非鱼对P的消化率随P和维生素D3含量的增加而升高;(3)饲料中的P和维生素D3含量对尼罗罗非鱼P收支产生显著影响.根据实验结果提出5条措施,以减少养殖过程中磷的排放.     

三聚氰胺对吉富罗非鱼的急性毒性研究

采用接触、腹腔注射及口服3种致毒方式,对吉富罗非鱼(GIFT Oreochromis niloticus)进行三聚氰胺的急性毒性研究.口服急性毒性实验中,在饲料中添加不同浓度的三聚氰胺,进行21d的吉富罗非鱼摄食养殖实验,实验鱼初体重为(55.00±0.05)g.实验结果表明:三聚氰胺溶解度较低,在接触实验中其水溶液没有表现出毒性,96LC50>3500mg/L;而在腹腔注射致毒方式下,三聚氰胺对吉富罗非鱼的半致死剂量LD50=1311.90mg/kg;LD5095%可信限为1169.06～1472.21mg/kg;在21d口服急性毒性实验中,添加三聚氰胺后不同程度地降低了吉富罗非鱼的摄食率和特定生长率,但对存活率和饲料系数均无显著影响.三聚氰胺对吉富罗非鱼21d的最大未观察到有害作用剂量(no-observed-adverse-effect-level,NOAEL)为31.00mg/(kg*d).     

不同低温条件下吉富罗非鱼的耐受性研究

应用室内人工降温,以0.5 ℃/2 h的降温方法研究吉富罗非鱼的低温耐受能力,分析比较不同低温条件下吉富罗非鱼的昏迷情况和死亡情况,评价其低温耐受性.结果表明:在8、9、10和11 ℃持续低温胁迫下,吉富罗非鱼的昏迷温度在8.9～10.5℃,半数昏迷温度为9.6℃左右;从开始出现昏迷到全部死亡的经历时间分别为14.5、18.5、24.5和28.5 h;昏迷维持时间与累计死亡率呈显著的线性相关,分别为:y=-0.0489x2+1.4330x-9.5078(R2=0.9999)、y=-0.0136x2+0.5024x-3.6385(R2=0.9649)、y=0.0038x2-0.0461x-0.1344(R2=0.9843)和y=-0.0034x2+0.2443x-3.2131(R2=0.9945).吉富罗非鱼的耐受性与时间和温度密切相关,其中8℃组耐受时间最短,11℃组最长.     

海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫效果的研究

用野外分离的海豚链球菌(Streptococcus iniae)海水菌株HD-1和淡水菌株TBY-1制备成含1×1010cfu/mL的灭活疫苗,以0.1 mL/尾的剂量对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)进行腹腔注射,免疫2次,测定免疫后1周、3周和5周免疫鱼血清中抗海豚链球菌的抗体滴度和相应菌株攻毒后的相对保护率,以评价海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫保护性.结果显示免疫鱼血清中抗体凝集效价在免疫后第3周和第5周呈显著性升高,且两种疫苗免疫血清存在明显的交叉凝集反应,说明HD-1和TBY-1抗原具有交叉免疫原性.在免疫后第4周,利用8倍半数致死量浓度(LD50)的海豚链球菌强毒菌株进行攻毒试验,结果显示:HD-1和TBY-1免疫组的死亡率分别为5%和0%,相对保护率分别为93.8%和100%;未经免疫的阴性对照组的死亡率分别为77.5%和62.5%.     

尼罗罗非鱼IgM单抗的制备及IgM+B淋巴细胞吞噬能力的研究

采用免疫亲和层析方法纯化尼罗罗非鱼抗TNP特异性IgM,并以此为抗原免疫Babl/c小鼠进行单克隆抗体制备. 免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合成杂交瘤细胞,利用酶联免疫吸附法、蛋白质印迹法(Western blot)和流式细胞术筛选获得两株抗IgM重链的单克隆抗体,分别命名为3B3和9D12. 纯化后的单克隆抗体3B3和9D12在1 mg/mL浓度下其抗体效价分别为740,741和359,712 units/mL. 利用制备的单抗结合激光共聚焦显微镜检测发现,膜结合型IgM位于B细胞膜表面(IgM+ B细胞). 流式细胞术检测尼罗罗非鱼IgM+ B细胞的免疫组织分布,发现IgM+ B细胞分布存在组织差异性,其中在外周血(PBL)所占比例最大,约为37.6%,其次是脾脏(SPL),占百分比33.7%,头肾(AK)占比例约为23.9%,而后肾(PK)占比例约为20%. IgM+ B细胞荧光微球的吞噬能力分析发现,IgM+ B细胞对0.5 m的荧光微球吞噬能力强于1 m. 另外,IgM+ B细胞的吞噬能力存在免疫组织差异性,其中对于0.5 m荧光微球的吞噬,PBL明显高于其他组织,而AK IgM+ B细胞对1 m荧光微球的吞噬能力最强. 以上结果表明,本研究成功制备了鼠抗尼罗罗非鱼IgM单抗工具,并利用其IgM单抗发现IgM+ B细胞具有吞噬能力且其吞噬能力存在组织差异性,表明IgM+ B细胞在先天性免疫中可能发挥重要作用.