番茄ACC合酶(LeACS2)在大肠杆菌中的可溶性表达

植物激素乙烯参与了植物生长发育等一系列生理过程,通过控制乙烯的合成进而控制经济作物的衰老和果实的成熟,给农业带来深远影响.ACC合酶是高等植物乙烯生物合成的限速酶.通过RT-PCR将番茄ACC合酶(LeACS2)cDNA克隆至大肠杆菌表达载体pET30a中并使之与GST 编码序列进行融合而构建了重组表达质粒pET-LeACS2-GST.转化获得含有该重组表达质粒的大肠杆菌BL21 starTM(DE3) pLysS细胞,在IPTG的诱导下成功表达出含有LeACS2的大小约83 000的融合蛋白.该融合蛋白具有较好的可溶性.通过GST亲和层析和MonoQ阴离子交换两步纯化后的LeACS2能够催化其底物SAM生成ACC.     

功能型DNA重组修复蛋白质RecR的体内分布示踪

RecR是参与大肠杆菌（E．coli）同源重组的蛋白质,在真核生物中存在功能保守性组分．通过构建recR-yfP融合基因及其表达载体,对大肠杆菌菌体内RecR蛋白的分布情况进行了活体观察．显微镜观察结果表明,RecR蛋白一般在菌体的拟核区起作用．通过对比紫外线敏感性,Re—cR—YFP在重组质粒上提高了recR缺陷型大肠杆菌的抗紫外线能力,表明重组质粒表达的融合蛋白RecR—YFP具有生物活性,能够提高recR缺陷型大肠杆菌的存活率．     

采用比较蛋白质组学方法研究p38β激酶对293T细胞蛋白质表达的影响

采用比较蛋白质组学方法研究了过表达p38信号通路激酶p38β对人类肿瘤细胞293T细胞蛋白质表达的影响．利用双向电泳和质谱技术分离鉴定了13个差异表达蛋白质．这些差异蛋白的分布从细胞质膜到核．其功能涉及核酸、蛋白质、糖脂类分子的转录、合成和成熟．细胞物质跨膜运输．细胞周期调控以及细胞防御等．献分析并没有发现上述鉴定的差异表达蛋白是p38β激酶现有直接底物的证据。提示其可能为新的p38β激酶相关蛋白．这些结果表明．比较蛋白质组学方法是寻找激酶新靶标的一种有效工具．     

巴尔通体HBPC蛋白原核重组表达及抗原性研究

为了寻找可用于巴尔通体(Bartonella)检测的特异性抗原,利用PCR方法从巴尔通体厦门分离株(B.tribocorum_XM)的基因组DNA中扩增出血红素结合蛋白C(HBPC)蛋白基因,并将该基因的编码区克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中,构建带GST标签的融合蛋白重组表达载体,并转化大肠杆菌(Escherichia coli DH5α),诱导表达GST-HBPC,通过亲和层析技术纯化GST-HBPC.最后运用蛋白质斑点印迹试验(Western blot)和间接ELISA法检验GST-HBPC是否具有抗原性.结果表明,所构建的表达载体可在大肠杆菌中大量表达GST-HBPC,Western blot和间接ELISA显示GST-HBPC能够特异性地与感染动物血液样本发生免疫反应.因此,体外重组的巴尔通体抗原蛋白HBPC可作为潜在的抗原用于巴尔通体血清学免疫检测.     

复杂网络分析激酶底物信号传递机制

为了研究信号从激酶到达底物蛋白质后的传递机制,本文将磷酸化和蛋白质相互作用结合构建网络,利用复杂网络理论对该网络进行分析.结果发现,底物中存在的社区结构不会只传递特定激酶组的信号,影响网络稳定性的关键节点大多参与肿瘤发生相关的信号途径.     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

具有磷酸酶活性的重组PTEN蛋白可抑制癌细胞的迁移

PTEN是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌因子,可通过对粘着斑激酶的去磷酸化抑制细胞迁移.在前期研究工作中证实了在大肠杆菌中表达的重组PTEN 蛋白具有抑癌活性后,本研究进一步检测重组PTEN 蛋白的磷酸酶活性及其对粘着斑激酶FAK 磷酸化程度和细胞迁移的影响.对[D3-32P]PIP3体外去磷酸化的实验表明重组PTEN蛋白具有明显的脂质磷酸酶活性;将重组PTEN蛋白转染DU-145细胞后,细胞中FAK的磷酸化水平明显下降,表明重组PTEN蛋白具有蛋白磷酸酶活性.细胞迁移实验结果表明转染的重组PTEN蛋白可以抑制DU-145细胞的迁移作用,从而起到抑制肿瘤转移或浸润的作用.     

新的STK11互作蛋白LOH12CR1的筛选及鉴定

PJ综合征（Peutz-Jeghers syndrome,PJS）的疾病基因STK11编码由433个氨基酸残基组成的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶STK11,具有调控细胞周期,调节细胞极性以及细胞基础能量代谢等重要功能．STK11蛋白羧基端含有123个残基,对STK11生物学功能的实现起着调节作用,但机制尚未明确．本研究利用pGEX4T-2原核表达系统,构建pGEX4T-2-STK11羧基端重组载体,并诱导表达了GST—STK11羧基端融合蛋白,采用GST—pull down结合质谱分析的方法,鉴定出STK11羧基端的可能互作蛋白LOH12CR1．通过免疫共沉淀技术证实了STK11激酶同LOH12CR1互作;免疫荧光共定位实验亦发现STK11与LOH12CR1共定位．STK11与LOH12CR1互作的发现为研究STK11的功能提供新的切入点．     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

酪氨酸激酶抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展

恶性肿瘤正一直严重威胁着人类生命，尽管诊断和治疗水平有所进步，但很多肿瘤生存率一直很低。近年来随着科学的发展，我们对肿瘤的生物学特性有了更深一步的认识。人类蛋白酪氨酸激酶（PTKs）在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用，它已成为一种很有前景的肿瘤治疗新靶点。PTKs抑制剂研究已成为当今世界抗肿瘤研究的热点领域，这些药物在临床前期研究中已显示很好的抗肿瘤效应，一些正在临床上作为很有前景的抗癌药。特别是BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂imatinib（STI571）在治疗慢性髓细胞白血病显著成功使得科学家们更热心于投入这一领域的研究，目前，至少有30多种酪氨酸激酶抑制剂在肿瘤治疗的不同临床试验阶段，大约120多个临床试验正在世界范围内进行。在此对酪氨酸激酶在肿瘤中的作用及酪氨酸激酶抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展作一综述。     

Src激酶抑制剂FB2抗前列腺癌作用研究

探讨Src激酶抑制剂FB2抗前列腺癌的作用及机制.整体动物实验观察FB2对人前列腺癌PC-3细胞在裸鼠异体中生长的影响;MMT、克隆原形成、细胞黏附试验观察FB2对肿瘤细胞增殖、黏附的影响;流式细胞术分析FB2对细胞周期的影响;Western blot观察细胞及组织内Src及p-Src表达.实验结果表明FB2抑制PC-3细胞裸鼠移植瘤的生长;FB2抑制PC-3细胞增殖及对基底膜成分的黏附,并将细胞周期阻滞于G1期;机制研究表明,FB2抑制PC-3细胞及瘤组织中Src激酶Tyr416磷酸化.因此Src激酶抑制剂FB2在体内外均有较强的抗前列腺癌作用,其机制可能与抑制Src激酶Tyr416磷酸化有关.     

Oscillatory change of SR-protein kinase activities during oocyte maturation meiosis in fish

The SR-protein kinase activity was analyzed and the cytological changes were observed during oocyte maturation in bisexual transparent color crucian carp ( Carassius auratus color variety). The results revealed that the SR-protein kinase activity was sensitive to the artificially induced spawning hormones, and the change of oscillatory activity was similar to that of the maturation-promoting factor (MPF) kinase that regulates meiotic cell cycle in fish.     

新型双芳基脲类Bcr-Abl激酶抑制剂的设计与合成

设计一系列新型双芳基脲类化合物作为潜在的Bcr-Abl激酶抑制剂。以2-吡啶甲酸,5-硝基吲唑,6-硝基喹啉等为原料合成了6个双芳基脲类化合物,结构经过1H-NMR鉴定。合成的6个目标化合物,均未见文献报道。     

Oscillatory change of SR-protein kinase activities during oocyte maturation meiosis in fish

The SR-protein kinase activity was analyzed and the cytological changes were observed during oocyte maturation in bisexual transparent color crucian carp ( Carassius auratus color variety) . The results revealed that the SR-protein kinase activity was sensitive to the artificially induced spawning hormones, and the change of oscillatory activity was similar to that of the maturation-promoting factor (MPF) kinase that regulates meiotic cell cycle in fish.     

Rice receptor-like kinase OsSI-RLK2 inhibits internode elongation

Receptor-like kinase participates in the early events of plant signal transduction pathways. Previously, we screened the receptor-like kinase genes in rice and performed phylogenetic analyses. In this study, we isolated a receptor-like kinase gene, OsSI-RLK2, from rice. Expression of OsSI-RLK2 was induced by ABA treatment. In vitro analysis indicates that OsSI-RLK2 has Mn2 dependent autophosphorylation activity, but does not have this activity in the presence of Ca2 and Mg2 . Transgenic rice with over-expressed OsSI-RLK2 displayed shortened internodes resulting in a dwarf phenotype. Taken together, these results suggest that OsSI-RLK2 may represent a new type of functional RLK in rice that can inhibit the elongation of the internode.     

乳酸对肌酸激酶活性抑制作用的研究

应用酶活测定的方法分析了肌酸激酶在不同浓度乳酸中的活性变化．实验结果说明在失活过程中没有蛋白质的聚沉；肌酸激酶的失活遵循一级反应的一相过程；失活与乳酸浓度和作用时间呈正相关．通过对比实验结果显示，乳酸是通过其解离状态的H^ 改变了机体PH值而影响肌酸激酶活性的，并且就乳酸对肌酸激酶影响及其意义进行探讨．     

牛磺酸抗心肌成纤维细胞增殖作用的实验研究

目的研究牛磺酸(Taurine,Tau)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导新生大乳鼠心肌成纤维细胞(myofibroblasts,myo Fbs)增殖的抑制作用,并探讨其作用机制.方法用AngⅡ诱导新生大乳鼠myo Fbs增殖,建立心肌纤维化(myofibrosis,MF)模型.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖;羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量;免疫细胞化学染色检测p-PKCα的膜转位及表达;Western blot检测p-PKCα和p-ERK1/2蛋白表达及含量.结果 Tau(30,60,120)mmol/L可明显抑制AngⅡ诱导的Myo Fbs增殖及胶原合成,同AngⅡ组比较差异具有统计学意义(P0.05或P0.01),并且呈现出剂量依赖性.应用免疫细胞染色Western blot并且结合图像分析,结果表明:Tau可抑制p-PKCα膜转位和表达,与AngⅡ组相比差异具有统计学意义(P0.01).结论 Tau可能通过减少p-PKCα的表达及膜转位,从而抑制MyoFbs增殖和胶原含量的增加,抑制MF,逆转心肌重塑.     

五种医用酶的硫酸按分级分离研究

采用硫酸铵分级沉淀法从一种兔肌匀浆上清中分步分离出醛缩酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶、肌酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶等五种医用酶。该法步骤简单、分离周期短、酶活回收率高、具有较大的实用价值。     

重组酵母Saccharom yces cerevisiae蛋白激酶Sch9的分泌表达与活性鉴定

为了深入研究蛋白激酶Sch9的生物化学特性,在Pichia pastoris酵母KM71H菌种中分泌表达并纯化了重组Sch9蛋白.进一步通过体外磷酸化实验分析了重组Sch9蛋白的蛋白激酶活性.通过重组蛋白质工程的手段初步研究了Sch9蛋白的生物化学和酶学特性.