猕猴桃褪绿环斑相关病毒RT-LAMP-LFD可视化检测方法的建立

猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot-associated virus, AcCRaV)是侵染猕猴桃的主要病毒之一.为实现对猕猴桃中AcCRaV的快速检测和监控,本研究建立了一种逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)结合横向流动试纸条(LFD)的检测方法,可实现快速、可视化检测猕猴桃中AcCRaV.本研究基于AcCRaV外壳蛋白基因保守区域,设计了一套LAMP特异性引物,优化后的反应体系在62℃恒温条件下,反应60 min,再进行5 min试纸条显色反应,即可完成样品的检测.检测灵敏性实验结果表明,建立的RT-LAMP-LFD方法具有较高的灵敏性,其检测灵敏度是常规RT-PCR的100倍.二者检测结果一致,LFD试纸条实现了检测结果的可视化.总之,该检测方法可为检测猕猴桃中AcCRaV感染状况提供了一种省时、高效的诊断方法.     

人乳头瘤病毒16和52型双荧光等温多自配引发扩增的

应用等温多自配引发扩增（IMSA）技术, 分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物, 并在检测体系中加入羟基萘酚蓝（HNB）和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂, 建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法. 结果表明： 340 μmol/L HNB与1∶10 000 SYBR GreenⅠ混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果, 455 nm蓝光激发下阳性反应管双荧光显色为黄绿色, 阴性反应管双荧光显色为橘红色; 该方法对HPV16和HPV52型检测限分别达60,600拷贝/μL, 可特异性检出样品中HPV16和HPV52, 与临床检测结果比对无差异.     

人乳头瘤病毒16和52型双荧光等温多自配引发扩增的检测方法

应用等温多自配引发扩增(IMSA)技术,分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物,并在检测体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂,建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法.结果表明:340μmol/L HNB与1∶10 000SYBR GreenⅠ混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果,455nm蓝光激发下阳性反应管双荧光显色为黄绿色,阴性反应管双荧光显色为橘红色;该方法对HPV16和HPV52型检测限分别达60,600拷贝/μL,可特异性检出样品中HPV16和HPV52,与临床检测结果比对无差异.     

应用液态悬浮芯片技术建立HPV基因分型方法

目的 应用液态悬浮芯片技术,建立一种新的人乳头瘤病毒(HPV)基因分型方法.方法 应用通用引物从HPV基因组中扩增出目的片断,与13型荧光微球偶联探针杂交,通过LuminexTM100检测HPV的型别.结果 检测十三型标准株质粒,对单一标准品和混合标准品均可准确分型.结论 初步建立了高通量、快速、可靠、适用于临床的人乳头瘤病毒分型基因诊断方法.     

小鼠肝炎病毒核酸快速检测方法的建立和应用

摘要: 为满足口岸对入境噬齿类动物快速检疫的需要,建立小鼠肝炎病毒( Mouse hepatitis virus,MHV) 快速核酸检 测方法。方法使用引物和TaqMan 荧光探针设计软件,针对MHV 保守基因设计引物和探针,建立了RT-PCR 和 Real-time RT-PCR 方法检测噬齿类动物临床样本中MHV 的方法。结果本研究建立的RT-PCR 和Real-time RTPCR 检测MHV 方法具有良好的特异性和敏感性,通过将建立的方法应用于MHV 阳性鼠临床样品的检测,证实两 种MHV 核酸检测方法具有良好的稳定性。结论本研究建立的RT-PCR 和Real-time RT-PCR 检测MHV 的方法, 适用于动物粪便、尿液等易于获得样本的检测。     

基于茎环法的RT-qPCR检测哺乳动物抗病毒siRNA的表达

抗病毒RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制在哺乳动物中保守存在,宿主通过病毒源siRNA(virus-derived small interfering RNA,vsiRNA)引导Ago2蛋白剪切病毒RNA,从而发挥抗病毒作用.为了建立快速检测宿主抗流感病毒(PR8ΔNS1)和野田村病毒(NoVΔB2)特异性siRNA分子的方法,根据病毒特异性siRNAs序列设计茎环引物和扩增引物,筛选出具有高特异性和灵敏度的茎环引物和PCR扩增引物(16768,3280和24～45),成功建立了茎环法RT-qPCR检测哺乳动物病毒源siRNA表达水平的系统.该方法快速简便,准确性高,兼具较高的特异性与灵敏度,可作为小RNA测序替代方案检测siRNA或在测序前对宿主产生的病毒源siRNA进行有效监测与评价.     

白斑综合征病毒(WSSV)和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp(WSSV)和168 bp(血卵涡鞕虫),与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

人博卡病毒微滴数字PCR定量方法的建立

为准确、快速地从临床鼻咽拭子样本中筛选出人博卡病毒(HBoV)感染的阳性样本,以HBoV-sh9基因的保守区序列为检测靶标合成引物和探针,建立了微滴数字PCR(dd PCR)检测HBoV的方法.结果表明:HBoV dd PCR方法具有较高的特异性,在(0.5~6.8)×10~3copies/μL HBoV DNA浓度范围内,具有良好的线性和精确度,定量限低至0.5 copies/μL.182份临床样本检测结果显示:HBoV感染的阳性率为8.24%.此建立的HBoV dd PCR方法在定量限、准确性和重复性上较常规PCR优势明显,不受样品基质和扩增效率的影响.     

实时荧光PCR方法检测含麸质的谷类产品管家基因

采用实时荧光PCR方法鉴别含麸质的谷类成分,选择大麦Hordein管家基因、小麦Gliadin管家基因、黑麦Sec1管家基因和燕麦Avenin管家基因作为物种鉴定的特异性标记基因,设计适合于Taqman探针实时荧光PCR扩增的引物和探针,从而达到鉴别检测食品中含麸质的谷类大麦、小麦、黑麦、燕麦成分的目的.特异性实验结果表明,分别采用大麦、小麦、黑麦、燕麦的引物和探针进行实时PCR扩增时,经检测25种样品,只有相对应的阳性物种样品产生荧光信号,其余非该物种样品均不产生荧光信号,表现出了很高的物种鉴定特异性.以大麦为例的灵敏性实验结果表明,原料样品检测灵敏性可达到0.01%,加工后的食品则可达到0.05%,符合食品成分痕量检测要求.     

实验动物雪貂阿留申病病毒核酸检测方法的建立

目的 建立阿留申病病毒PCR检测方法,以用于实验动物雪貂阿留申病病毒的检测。方法 参考Genebank中阿留申病病毒核酸VP2基因序列设计一对引物,建立PCR检测方法,进行特异性、敏感性测试,并对实验雪貂粪便样品进行筛查。结果 测序结果显示,使用设计的引物可特异性地扩增获得阿留申病病毒的VP2中531 bp基因片段;在常见实验动物DNA病毒,小鼠多瘤病毒、小鼠细小病毒、犬细小病毒、疱疹病毒、鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠腺病毒中均未扩增出目的条带;以目的片段核酸为模板测试该方法敏感性,检测下限达到90. 6 copy/μL。应用该方法对39份雪貂粪便样品进行检测,未检测出阿留申病病毒核酸阳性。结论 本研究建立的方法具备一定的特异性和敏感性,可作为实验动物雪貂中阿留申病病毒感染病原筛查的方法。     

建立实时荧光PCR快速鉴定鸡制品中鸡伤寒沙门氏菌的方法

建立基于Taqman探针实时荧光PCR检测鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)的方法.根据GenBank公布的鸡伤寒沙门氏菌基因序列,设计引物和Taqman探针,采用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验.结果表明:特异性引物和探针可从34株鸡伤寒沙门氏菌菌株、26株其他血清型沙门氏菌和7株非沙门氏菌菌株中检测出全部的34株鸡伤寒沙门氏菌.以鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验,菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系,线性系数(R2)为0.999,扩增效率为88.2%,最低检测浓度为5cfu/mL.对已接种鸡伤寒沙门氏菌的模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定,两者结果一致.该方法特异性好、灵敏度高,是快速鉴定鸡伤寒沙门氏菌的有效方法.     

鼠脑心肌炎病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立快速诊断鼠脑心肌炎病毒感染的荧光定量RT-PCR方法。方法根据鼠脑心肌炎病毒(EMV)PEC9毒株全基因组序列(Gen Bank登录号:DQ288856.1),设计一对特异性引物和TaqMan探针,建立EMV的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果建立的荧光定量PCR方法,标准曲线的线性关系良好,r2值可达0.99,敏感性最低检测限为1个拷贝数,高于普通PCR方法 1000倍,其特异性强,与其他常见感染的小鼠病毒株均无特异性扩增,批内和批间变异系数均小于2%。利用该方法对上海市120份小鼠心肌样品进行检测,未检测到阳性感染。结论本研究为鼠脑心肌炎病毒感染的分子检测,为制定国家标准提供良好的方法。     

高致病性禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断高致病性禽流感,根据H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,利用这两对引物对H 5,H 7亚型禽流感病毒的HA基因片断进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这两对引物能特异性地扩增出H 5,H 7亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490 bp和375 bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H 5,H 7亚型高致病性禽流感病毒的分子诊断方法。     

三种PCR引物法制备生物素标记的HpLV衣壳蛋白基因cDNA探针检测效果的比较

采用正义、反义引物及正义和反义引物双链PCR法制备了生物素标记的HpLV衣壳蛋白基因的cDNA探针。检测结果表明，三种PCR引物法标记的cDNA探针显色灵敏度均可达到10ps／μL，对目标基因DNA的检测灵敏度可达90ps／μL，但反义引物PCR法标记探针的检测效果要好于正义和反义引物双链PCR法制备的探针；在目标基因DNA浓度一定的情况下，探针的浓度对检测效果的影响并不大；正义、反义引物PCR法制备的探针可不经煮沸变性处理直接使用；用50ng／mL浓度的反义引物PCR法制备的生物素标记cDNA探针可检测到带毒啤酒花叶片和花瓣中的啤酒花潜隐病毒RNA。     

九味羌活丸和香砂养胃丸制剂米粉掺伪检测方法的建立和质量标准的制定

目的:建立荧光探针PCR检测方法并拟定质量标准,旨在实现快速、准确地检出九味羌活丸(水丸)和香砂养胃丸(水丸)中的掺伪米粉.方法:通过优化样品提取方法,有效提取九味羌活丸和香砂养胃丸复方的基因组;通过文献检索和生物信息学分析,筛选得到适用于本试验的米粉特异性引物和TaqMan探针,并优化PCR检测方法.实验对方法的特异...     

食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立

食品及其原料中沙门氏菌的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.根据沙门氏菌invA基因核苷酸序列设计一组引物,应用环介导等温扩增技术（LAMP）,分别对7种不同血清型沙门氏菌和4种非沙门氏菌进行扩增,同时建立沙门氏菌人工污染的食品模型,比较了LAMP法与活菌计数检测的敏感性.结果表明,该方法仅对沙门氏菌产生特异性扩增,灵敏度高达336,mL-1,食品样品经细菌富集培养后,检测灵敏度高达8.25,g-1.所建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于沙门氏菌污染食品的快速检测.     

应用聚合酶链式反应检测犬细小病毒

将具有犬细小病毒病典型症状的病犬肠溶物经ＳＤＳ－酚裂解法提取总ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,通过人工合成的两条２０ｍｅｒ引物进行ＰＣＲ扩增,该对引物扩增的片段为犬细小病毒结构蛋白ＶＰ２基因中间１／３区段,ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳,试验结果表明：用ＰＣＲ扩增检测犬细小病毒具有良好的特异性,应用该方法检测的２７份病犬肠溶物样品块获得了预计长度的ＤＮＡ片段（５３１ｂｐ）,而健康犬的肠溶物样品ＰＣＲ结果为     

RT—PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）为草鱼出血病的病原．本实验根据GenBank中GCRV和其他水生呼肠孤病毒毒株的第六基因片段,在其保守区设计了一对GCRV特异性引物,建立了快速检测GCRV的逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法．该PCR体系中,上下游引物的最适终浓度为120nmol／L,最适退火温度为52℃．PCR特异性试验表明：所设计的引物只能扩增GCRV的核酸,而不能扩增嗜水气单胞菌BSK-10、WSSV以及正常CIK细胞的DNA或RNA．敏感性试验表明,当GCRV的反转录模板稀释至5-7时,PCR结果还为阳性．用所建立的RT—PCR方法对5份样品进行检测,结果表明本研究建立的RT—PCR检测方法可靠且可行．     

大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定

目的:建立一种快速、准确的大黄鱼小黄鱼实时荧光PCR鉴定方法.方法:根据GenBank中大黄鱼、小黄鱼线粒体中ND6基因的序列,设计并合成特异性引物和cycling探针,以草鱼为阴性对照,进行实时荧光PCR反应.结果:利用设计合成的大黄鱼和小黄鱼特异性引物和cycling探针进行实时荧光PCR反应,大黄鱼和小黄鱼均产生特异扩增曲线,对照的草鱼没有产生扩增曲线.结论:利用设计的引物和cycling探针,可准确快速鉴定大黄鱼和小黄鱼.     

大熊猫粪便样品中犬瘟热病毒的检测

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列,设计合成1对特异性引物,以犬瘟热病毒疫苗中提取的RNA为阳性模板建立了快速检测CDV的RT-PCR方法,结果显示,所建立的CDV RT-PCR扩增得到与理论设计值大小一致的456 bp的特异性片段,对犬细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、大肠杆菌(E.coli)和新城疫病毒(NDV)的扩增结果均为阴性;最低可检出约1.53×10~2拷贝/μL的核酸;重复性试验结果表明,该方法检测重复性好.此方法对成都大熊猫繁育研究基地的37份眼观正常的大熊猫粪便样品检测,未检测出犬瘟热病毒,与胶体金试纸卡检测结果一致.