基于线粒体COⅢ基因变异鉴定黄渤海地区海鱼种类

本研究根据GenBanK发布的核苷酸数据库信息,设计扩增鱼类线粒体COⅢ基因的通用引物,扩增黄渤海地区7种重要商品海鱼(光鱼、梭鱼、鲫鱼、舌鳎、扒皮鱼、六线鱼、白姑鱼)的COⅢ全长基因序列.对扩增产物进行测序、比对,利用分子生物学软件进行序列酶切分析,最终选用Nla Ⅲ限制性内切酶进行酶切,并获得了所研究的各鱼种的特异酶切片段图谱.结果表明,利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术能有效地区分以上7种海鱼,PCR-RFLP技术应用在鱼种鉴定上具有快速、准确的优势.     

暗纹东方鲀线粒体若干tRNA基因的克隆及序列分析

利用分离纯化的暗纹东方鲀肝脏mtDNA为模板，按照红鳍东方纯（Takifugu rubripes）mtDNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增，首次克隆并测定了暗纹东方纯mtDNA的Cytb、COⅠ、COⅡ、COⅢ、D-loop等5个重要基因及其侧翼的8个tRNA基因。上述基因均已在GenBank登录。8个tRNA基因含有69-72个碱基。推定了各个tRNA的二级结构并进行了初步的序列分析。结果表明：8个tRNA基因具有较为典型的三叶草型结构，各臂的碱基配对率大多数较高，稳定性较好.     

日本囊对虾线粒体DNA COⅠ基因片段序列分析

以相应引物对日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基基因(mtDNA COⅠ)进行PCR扩增,经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序,得到709 bp的碱基片断.碱基组成A、C、G、T含量分别为196bp(27.64%)、129 bp(18.19%)、134 bp(18.90%)、250 bp(35.26%).与GenBank中斑节对虾(Penaeus monodon)的mtDNA CO I全序列(AF217843)比对.经分析发现本实验获得的日本囊对虾mtCO Ⅰ基因片段序列和GenBank上的同种序列(AY264897)都只是该种COⅠ基因序列的一部分,二者之间有41bp的重叠并可拼接.拼接后的总长为1515 bp.     

应用3’RACE技术扩增仿刺参C型凝集素基因及实验条件的优化

从GenBank上调取刺参C型凝集素（C-type Lectin）基因序列EST,根据此序列设计RACE引物,采用PCR扩增技术得到了仿刺参C-type Lectin基因序列（EST）,根据这段EST序列设计1个基因特异引物（GSPF）,与通用引物（UPM）扩增,成功地克隆到了该基因的3’末端序列.同时,对仿刺参C型凝集素基因3’克隆的实验条件进行了优化.该扩增片段长度为670bp,与已知序列重叠部分为417bp.经测序和比对发现该段序列与预期的目标基因的序列一致.     

暗纹东方鲀线粒体12S rRNA基因的克隆及序列分析

利用提取纯化的暗纹东方纯肝脏的mtDNA为模板,按照红鳍东方纯mtDNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,首次克隆并测定了暗纹东方纯mtDNA的12S rRNA基因.同时运用DNA分析软件,对暗纹东方纯与GenBank中选取的几种同目鱼类的相应序列进行比较分析,显示暗纹东方纯与这些鱼类的12S rRNA基因具有较高的同源性.利用分子生物学相关软件,对暗纹东方纯及与其同目的5种鱼的12S rRNA基因序列建立NJ和MP分子进化树,并与传统的分类地位进行比较,结果表明与传统的分类地位基本吻合.     

纤细眼虫(Euglena gracilis)核纤层蛋白基因的初步研究

目的：探讨在纤细眼虫(Euglena gracilis)中是否存在核纤层蛋白(lamin)基因，为核纤层蛋白基因的起源与进化研究提供线索．方法：以较为低等生物的核纤层蛋白基因cDNA序列为参考，设计引物P0010和P0012，以纤细眼虫总DNA为模板进行PCR，PCR产物回收、测序．由于不能获取完整序列，所以据测序结果又设计了P0013和P0014两条中间引物，组成P0010／P0013和P0014／P0012引物对进行PCR，回收产物测序．结果：P0010／P0012、P0010／P0013和P0014／P0012引物对进行PCR分别获得775、400和395bp的特异性PCR产物，对这3种产物分别测序，最终获得了P0010和P0012之间的全序列，共775bp．结论：在纤细眼虫中存在着核纤层蛋白基因．     

百合花发育相关基因LLGLO1的RNAi载体构建

百合花发育相关基因的研究是开展花卉分子育种的重要基础。以麝香百合(Lilium longi-florumThumb.)未开放的花蕾为材料提取总RNA。根据LLGLO1序列的同源比对选取特异区段,设计引物扩增区段cDNA并引入酶切位点。将PCR扩增片断连接到T载体上,经酶切及PCR验证后进行测序。测序结果表明:用于RNAi的cDNA片断与LLGLO1序列完全相同。通过中间载体pSK+intron引入一段内含子间隔区,RNA干扰片断经过多次的酶切和连接过程最终连入表达载体pCAMBIA1301中形成ihpRNA结构。PCR及双酶切鉴定结果显示,构建的RNA干扰载体的ihpRNA结构完整。     

六安地区高粱花叶病毒P3基因的克隆和序列测定

从六安产甘蔗病叶中提取总RNA,逆转录获得甘蔗花叶病毒(Sorghun mosaic virus,SrMV)基因组cDNA。设计P3基因特异引物,通过PCR扩增P3基因,并将P3基因cDNA克隆、测序。     

基于线粒体DNA多态性鉴定烟台海鲜市场鱼种

由烟台海鲜市场随机采集具有相对重要商业价值的10种海鱼(小黄鱼、牙片、鲅鱼、面条鱼、鲐鱼、鲳鱼、鲈鱼、偏口、黑鱼、白姑鱼),利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对鱼种进行鉴定.首先提取10种海鱼的基因组DNA,利用自行设计的通用引物对其线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因(MT-co3)进行PCR扩增,对扩增产物克隆、测序,用NCBI数据库检索,确定了10种海鱼的鱼种.依据测序结果进行限制性内切酶酶切分析,选用NlaⅢ和HinfⅠ2种内切酶进行酶切,获得了各种鱼类特异的酶切片段图谱.研究结果表明,PCR-RFLP能有效地区分以上10种海鱼,在鱼种鉴定上具有简便、准确的优势,可为鱼类食品检测提供科学依据.     

Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用

多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链DNA为基础的,如何获得大量和高质量的单链靶DNA分子一直是研究热点.以包含BRCA1基因上3个单核苷酸多态性(SNP)的DNA片段为研究对象,通过调整不对称扩增引物碱基序列组成(5′-端引入错配或加入锁核苷酸(locked nucleic acid,LNA)),使用相差10倍浓度来增加不对称引物间Tm值差异,改进扩增条件(添加增强剂的扩增缓冲液,不同退火温度的二阶循环扩增程序)后,进行不对称扩增来产生大量单链靶DNA产物.结果表明Tm差异型不对称PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高单链DNA分子产率,降低引物设计难度,也扩大了模板序列的适用范围.此外,还针对禽流感病毒H5N1的血凝素(haemagglutinin)HA基因保守序列进行不对称扩增,用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测,所得结果与参考序列一致且无明显干扰信号.因此,采用Tm值差异型不对称PCR可使焦磷酸测序等分子诊断流程更为简便,成本更低,效率更高,具有很好的通用性和实用性.     

中药材羌活鱼引物特异性PCR鉴定

应用引物特异性PCR技术的原理和方法,根据已有Cyt b基因DNA序列的比对结果,设计可以特异扩增羌活鱼源动物包括山溪鲵属Batrachuperus的全部物种的PCR引物1对,SXNS1(上游引物)5′-GGGTCTGCTTAATCTCACAAATTAT-3′,SXNS2(下游引物)5′-CAATTA AAAATGGGAATAAGAAATG-3′.结果表明该对引物可以用于正品羌活鱼和混伪品的分子鉴定.     

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1，R1)，扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理，巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物，使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列，又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分；另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对，从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列，还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增，避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程，优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4，R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。     

暗纹东方纯线粒体12S rRNA基因的克隆及序列分析

利用提取纯化的暗纹东方鲍肝脏的mtDNA为模板,按照红鳍东方鲍mtDNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,首次克隆并测定了暗纹东方纯mtDNA的12S rRNA基因。同时运用DNA分析软件,对暗纹东方纯与GenBank中选取的几种同目鱼类的相应序列进行比较分析,显示暗纹东方鲍与这些鱼类的12S rRNA基因具有较高的同源性。利用分子生物学相关软件,对暗纹东方纯及与其同目的5种鱼的12S rRNA基因序列建立NJ和MP分子进化树,并与传统的分类地位进行比较,结果表明与传统的分类地位基本吻合。     

网翅蝗科(Arcypteridae)部分种类全基因组提取及16S rRNA基因和COⅠ基因测序

通过实验提取中国甘肃境内网翅蝗科蝗虫全基因组DNA序列,探索了直翅目蝗虫的总 DNA提取方法;通过特异性引物,对线粒体16S rRNA基因和COⅠ基因序列进行了扩增,并通过 多次预实验探索这两个基因在网翅蝗科昆虫中扩增的最佳条件,为将来的网翅蝗科系统发育分析 奠定了实验基础.扩增好的样品用于测序,测序结果可用于分析6种蝗虫的系统发育关系.     

黄海带鱼、小带鱼RAPD和线粒体16S rRNA基因序列变异分析

对黄海带鱼、小带鱼各12个个体进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析,对比多态位点比例、遗传多态度以及遗传距离,并构建Neighbor-joining系统树;通过PCR扩增出线粒体16SrRNA基因,纯化后直接测序,利用生物信息学方法进行序列分析和核苷酸变异比较,结合GenBank上大西洋叉尾带鱼同源序列构建UPGMA系统树.分析结果表明:(1)RAPD技术研究黄海带鱼和小带鱼的遗传多样性具有较高的灵敏度和检出率,带鱼的多态比例和遗传多态度均较小带鱼的低;(2)线粒体16S rRNA基因序列在分析这两物种遗传变异时表现出保守和变异的双重特性,种内变异极小而种间较大;(3)5个随机引物扩增出种特异的RAPD带,可作为种间分子鉴定标记;(4)研究证实带鱼和小带鱼是不同属的两个种,从而在基因水平上支持了Nelson分类系统的观点.     

虎纹蛙病毒的ATP酶基因克隆和序列分析

利用对应于蛙病毒—3型(FV3）ATP酶基因(ATPase)的162—178nt和1186—1174ntt碱基序列作为引物，采用PCR方法扩增得到虎纹蛙病毒(RTV)的ATP酶基因，并对该基因进行克隆、测序和分析。基因读码框大小为945hp，预计可编码一相对分子质量为35500的蛋白质。氨基酸序列比较结果，RTV的ATPase基因与虹彩病毒科蛙病毒属的代表种FV3的一致性最高，为87．9％，与该科其它脊椎动物病毒的一致性在50％-52％之间。ATP酶蛋白质结构域分析可知该基因编码的ATP酶含有Walker型ATP酶AAA族蛋白质的全部结构域，其中既具有Walker型ATP酶所具有的Walker a和Walker b保守区，还含有AAA族蛋白质基因所具有的SRH高度保守区，因此，该基因是一完整的活性蛋白编码基因。     

以 16S-23S rDNA 间区序列为目的基因设计 PCR 引物鉴定多杀巴斯德氏菌

多杀巴斯德氏菌是养殖动物(鸡,猪,牛等)的重要致病菌.本研究以16S-23S rDNA间区序列为目的基因设计PCR引物鉴定多杀巴斯德氏菌.通过对多杀巴斯德氏菌ITS-IA(含有tDNA-Ile和tDNA-Ala的16S-23S rDNA间区序列)的测序和与GenBank中序列的BLAST,设计筛选了一对特异引物PS-F/PS-R.对引物的特异性和有效性,用PCR方法进行了验证.结果表明:所有的多杀巴斯德氏菌标准菌株和分离菌株都能被检出,而全部39株非多杀巴斯德氏菌都没有扩增出特异性条带.其检测灵敏度能达到102CFU/mL.研究结果表明,发展了的PCR鉴定方法是省时的和可靠的,整个过程只需要20 h,而传统的鉴定方法需要至少5 d的时间.     

灯盏花CHI基因的再克隆及其绿色荧光蛋白表达载体构建

根据灯盏花转录组所注释的CHI unigene片段,设计了RACE相关引物,克隆到灯盏花CHI的cDNA全长序列,序列全长717bp,编码238个氨基酸.该氨基酸序列与我们前期所克隆的灯盏花CHI cDNA序列相比,在345、351位点发生了突变,碱基均由C突变为T,两个位点的突变均属于同义突变,编码的氨基酸分别为115、117位异亮氨酸、酪氨酸.同时将CHI基因片段插入到pDM 18-T,构建pDM 18-T-eBCHI中间载体.经测序验证后,根据pBI121-EGFP图谱,设计带有SalI、SpeI酶切位点的引物,以pDM 18-T-eBCHI中间载体为模板,扩增带酶切位点的CHI序列,扩增产物经回收、纯化后与双酶切的pBI121-EGFP链接,构建了重组表达载体pBI121-EGFP-CHI,CHI基因插入植物表达载体pBI121-EGFP的6xHis组氨酸标签与GFP基因间.经SalI、SpeI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,CHI基因已成功地连接到pBI121-EGFP-eBCHI中.采用电击转化法将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101,用叶盘法转化灯盏花叶片,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和叶绿素荧光成像检测证明,重组基因已成功地转化到灯盏花愈伤组织中.为利用转基因技术研究CHI基因的表达及其亚细胞定位打下基础.     

采用反向PCR技术优化适合毕赤酵母表达的截短型HPV58型L1基因

目的:探讨利用反向聚合酶链反应(反向PCR)技术根据毕赤酵母偏爱密码子优化截短型人乳头瘤病毒58型(HPV58)L1基因的研究.方法:设计PCR引物扩增截短型HPV58L1目的基因,将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC;测序并对目的基因进行序列分析;根据毕赤酵母偏爱密码子利用反向PCR技术设计引物对目的基因进行扩增.结果:扩增了截短型HPV58L1基因并将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC中;根据毕赤酵母偏爱密码子优化了截短型HPV58L1基因.结论:成功构建经密码子优化截短型HPV58L1基因的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC-HPV58L1.     

利用细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(CO Ⅰ)基因鉴定宠物仓鼠

为探究DNA条形码技术在商品宠物仓鼠的品系鉴定中的可行性,以金丝熊、虎纹熊、眼圈熊、奶牛熊、银狐、紫仓、奶茶、布丁、老婆婆共9个品系36只宠物仓鼠为动物材料,无损取材后,提取基因组DNA,利用特异性引物对线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因进行PCR扩增测序,通过遗传距离和系统进化分析鉴定仓鼠的物种分类.结果显示:1)36个样本均成功扩增出长度为750bp左右的COⅠ基因片段;2)宠物仓鼠中的熊类均属于中仓鼠属(Mesocricetus)物种,其他品系则分属于毛足鼠属(Phodopus)和仓鼠属(Cricetulus)的4个物种,各品系之间谱系混乱.本研究认为,COⅠ基因是适宜于物种鉴定的分子标记,但对宠物仓鼠品系的鉴定和区分能力不足.