一氧化氮参与茉莉酸诱导蚕豆气孔关闭的信号转导

用一氧化氮(NO)特异性荧光探针DAF-2DA结合激光共聚焦显微技术证明蚕豆气孔保卫细胞中存在NO. 从以下几个方面证明NO可能参与JA调控气孔运动的信号转导过程: (ⅰ) 外源JA促进叶片气孔保卫细胞NO的合成; (ⅱ) JA和NO都能够诱导气孔关闭, 并具有浓度效应; (ⅲ) 低浓度的NO和JA之间在诱导气孔关闭上存在一定的加合效应; (ⅳ) NO的清除剂PTIO可大大减弱JA诱导蚕豆气孔关闭的作用, 一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME能够抑制JA 诱导的蚕豆气孔关闭效应, 也可以抑制JA诱导保卫细胞中NO的产生. 推测JA处理诱导保卫细胞中NO的产生主要来源于NOS合成途径.     

一氧化氮参与水杨酸对蚕豆气孔运动的调控

研究了一氧化氮(NO)在水杨酸(SA)诱导蚕豆气孔运动中的作用. 结果表明, 在一定范围内, SA和NO都可诱导气孔关闭. 100 mmol/L SA能够提高保卫细胞胞质中NO的水平, NO清除剂和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂都能够降低SA引起的胞质NO的增加. 同时, NO的清除剂PTIO和NOS的抑制剂L-NAME几乎能够完全抵消SA诱导气孔关闭的效应. 推测SA通过NOS途径诱导形成NO, 进而诱导气孔关闭. 鸟氨酸环化酶的抑制剂ODQ和 cADPR的拮抗剂烟碱能够减弱SA和NO诱导气孔关闭的作用. 表明在SA和NO诱导气孔关闭的过程中可能需要有cGMP和cADPR介导.     

NO 介导的H2S 合成参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

以拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 野生型和突变体为材料, 利用激光共聚焦显微技术、实时定量PCR 和分光光度法, 结合药理学实验, 探讨两种气体信号分子硫化氢 (hydrogensulfide, H₂S) 和一氧化氮 (nitric oxide, NO) 在乙烯 (ethylene, Eth) 调控气孔运动中的相互关系. 结果表明, H₂S 合成抑制剂能明显抑制乙烯诱导的拟南芥气孔关闭; 乙烯能够显著增加拟南芥叶片的H₂S 含量, 提高L-/D-半胱氨酸脱巯基酶 (磷酸吡哆盐依赖性酶) (L-/D-cysteinedesulfhydrase, L-/D-CDes) 活性及AtL-CDes 和AtD-CDes 的转录水平; 清除NO 可减弱乙烯的诱导效应; 乙烯亦可明显诱导Atnoa1 突变体叶片H₂S 的积累, 但对Atnia1,nia2 突变体没有明显作用; H₂S 合成抑制剂对乙烯诱导气孔保卫细胞和叶片的NO 水平升高以及硝酸还原酶(nitrate reductase, NR) 活性增强没有明显影响, 同样乙烯可以诱导Atl-cdes 和Atd-cdes 突变体保卫细胞NO 水平升高, 说明H₂S 和NO 均参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭, 且NO 可能位于H₂S 上游参与调控这一信号通路.     

胞质pH变化介导乙烯诱导的拟南芥保卫细胞NO产生和气孔关闭

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为实验材料, 用药理学实验、激光共聚焦显微技术和分光光度法研究了保卫细胞胞质pH和一氧化氮(nitric oxide, NO)在乙烯(ethylene, Eth)调控气孔运动信号转导中的作用. 结果表明, 乙烯利和乙烯前体物ACC都能够引起保卫细胞内胞质pH和NO的水平升高; 弱酸(乙酸)以及质膜H+-ATP酶的抑制剂钒酸钠可以逆转乙烯诱导的拟南芥气孔关闭, 同时减弱乙烯所引起的NO含量增加和硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)活性的增强; 而NO清除剂cPTIO对胞质pH无显著影响. 可以推测, NO和pH均参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭作用, 且胞质pH的变化(主要由质膜H⁺-ATPase引起的)可能位于NO (主要由NR途径产生)上游介导这一过程.     

血红素加氧酶催化产生的CO参与ABA诱导的蚕豆气孔关闭及其信号转导

一氧化碳(CO)是哺乳动物中新发现的一种重要的生物活性/信号分子, 其生物学效应往往通过一氧化氮(NO)和环鸟苷酸(cGMP)信号介导. 本研究发现, 可引起蚕豆叶片气孔关闭的ABA处理能诱导蚕豆叶片CO释放的增加以及CO合成酶血红素加氧酶(HO)活性的提高; 同时, ABA诱导的蚕豆气孔关闭也可以被CO合成酶抑制剂ZnPP和CO/NO清除剂血红蛋白(Hb)部分阻断. 进一步的研究表明, 外源添加CO供体高铁血红素(Hematin)和CO水溶液不仅能促进CO的释放, 还能以依赖于时间进程的形式诱导蚕豆气孔的关闭, 后者与NO供体SNP处理的结果相类似; NO合成酶硝酸还原酶(NR)的抑制剂钨酸钠(Tungstate), NO专一性清除剂cPTIO, ZnPP和Hb不同程度地逆转了这一过程. 在4 h的处理过程中, SNP, 0.01%饱和度的CO水溶液以及Hematin明显地激发了NO的产生; 反之, 结合cPTIO或Tungstate处理后, NO的荧光信号几乎被完全抑制. 此外, 鸟苷酸环化酶(GC)的抑制剂ODQ阻断了CO诱导的气孔关闭, 而ODQ的作用又被cGMP的类似物8-Br-cGMP所逆转. 上述结果暗示, HO产生的CO可能参与了ABA诱导的蚕豆气孔关闭, NO和cGMP则是CO信号通路的下游分子.     

拟南芥保卫细胞微管骨架的重排参与NO诱导的气孔关闭

以GFP:α-tubulin-6转基因拟南芥为材料, 利用药理学实验及激光扫描共聚焦显微技术研究了微管骨架在NO诱导气孔关闭过程中的动态变化及其可能的调控机制. 结果表明: (ⅰ) 微管特异性抑制剂长春花碱和NO供体SNP均能诱导气孔关闭, 并且长春花碱能加强SNP对气孔开度的抑制作用, 而微管稳定剂紫杉醇则部分抑制了NO对气孔关闭的诱导作用; (ⅱ) 开放气孔保卫细胞中, 大量周质微管从保卫细胞的背壁向腹壁呈辐射状整齐规则地排布, 并且几乎所有微管纤维都与保卫细胞腹壁成90°垂直; (ⅲ) 同一条件下保卫细胞经外源NO供体SNP光下处理30 min, 保卫细胞内整齐的辐射状微管逐步散乱, 微管部分解聚, 纤维数量减少, 部分交错扭曲, 排布方式也由与腹壁垂直转变为倾斜, 说明微管骨架可能参与了NO诱导的气孔关闭; (ⅳ) 进一步研究发现, 胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM可以大幅度削弱由NO诱导的气孔关闭作用, 而对长春花碱诱导的气孔关闭无明显影响; 开放气孔的保卫细胞经SNP处理后, 再施加BAPTA-AM, 散乱的微管骨架排布随处理时间延长逐步趋于正常, 到30 min时基本恢复成辐射状, 与对照相比无明显区别, 表明在NO对微管排布的调节机制中有Ca²⁺参与. 综合以上结果推测, 在NO调控的气孔运动中, NO可能是通过调节胞内Ca²⁺来促进微管骨架系统的重排, 进而影响气孔的开关运动.     

Ca2+参与蚕豆保卫细胞中毒蕈碱型受体介导的乙酰胆碱信号转导

动物神经递质乙酰胆碱(ACh)也存在于植物体内, 并发挥多种重要生理功能. 一定浓度的ACh可诱导气孔开放. 以Ca²⁺荧光指示剂Fluo-3AM为探针, 利用激光共聚焦扫描显微镜观察ACh调控气孔运动中保卫细胞胞质Ca²⁺的动态变化. 结果证明, 外加ACh促使保卫细胞胞质Ca²⁺的瞬时增加. 毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)的激活剂毒蕈碱与ACh的作用类似, 也能激活胞质Ca²⁺的瞬时增加; 反之, 毒蕈碱型受体的抑制剂阿托品预处理则抑制ACh诱导的Ca²⁺增加, 这与动物中mAChR的作用机制类似. 用EGTA螯合胞外Ca2+或用钌红阻断液泡Ca²⁺的释放, 结果表明ACh诱导的保卫细胞胞质Ca²⁺增加主要来源于胞内Ca²⁺库的Ca²⁺释放. 研究表明, 经过mAChR介导, Ca²⁺参与保卫细胞响应ACh刺激的信号转导.     

NO参与真菌诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL活化和紫杉醇生物合成的促进作用

由桔青霉(Penicillium citrinum)细胞壁制备的诱导子可以诱发红豆杉悬浮细胞产生多种防卫反应, 包括NO合成、PAL活化和紫杉醇合成加强. NO淬灭剂cPTIO和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂PBITU可以阻断桔青霉诱导子对红豆杉悬浮细胞中PAL活化和紫杉醇合成的促进作用. NO供体SNP单独处理也可以触发红豆杉细胞中PAL活化和紫杉醇合成加强. PBITU可以抑制桔青霉诱导子诱发红豆杉悬浮细胞中NO的增加. 实验结果证实了在桔青霉诱导子处理下红豆杉悬浮细胞中NO合成与PAL活化和紫杉醇合成加强之间的因果关系, 表明桔青霉诱导子诱导红豆杉悬浮细胞通过NOS产生NO, NO作为信号分子活化PAL并触发紫杉醇生物合成.     

一氧化氮通过依赖和不依赖活性氧的信号途径介导桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉悬浮细胞中紫杉醇生物合成

一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)是植物体内两种常见的信号分子, 在植物抗逆反应等过程中起重要作用. NO合成和氧化迸发(oxidative burst)以及ROS积累是红豆杉悬浮细胞在桔青霉细胞壁诱导子处理下出现的两个早期反应. 为了探讨NO和ROS在桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉细胞紫杉醇合成过程中的作用及其相互关系, 分别以NO专一性淬灭剂cPITO, 一氧化氮合酶(NOS)抑制剂PBITU, 质膜NAD(P)H氧化酶抑制剂DPI以及超氧离子(O₂^-)和过氧化氢(H₂O₂)淬灭剂超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)处理红豆杉细胞. 结果表明, cPITO和DPI不仅可以分别抑制红豆杉细胞的NO合成和ROS积累, 同时还可以阻断诱导子对紫杉醇合成的促进作用, 说明NO和ROS是参与桔青霉细胞壁诱导子促进红豆杉细胞中紫杉醇合成调控的信号分子. cPITO和PBITU同时还可以部分抑制诱导子对红豆杉细胞氧化迸发的诱发作用. 外源NO单独处理可以促进红豆杉细胞中紫杉醇合成, DPI可以抑制NO对紫杉醇合成促进作用. 然而, 即使在红豆杉细胞中ROS积累被完全抑制的情况下, NO和桔青霉细胞壁诱导子对细胞中紫杉醇的合成仍然具有一定的促进作用. 上述结果表明, NO可以通过依赖和不依赖ROS的两类不同信号途径介导真菌诱导子诱发红豆杉细胞中紫杉醇的生物合成. 实验结果同时也表明, NO和桔青霉细胞壁诱导子对红豆杉细胞中紫杉醇合成的促进作用可以被CAT抑制, 但不受SOD的影响, 说明氧化迸发产生的H₂O₂可能是介导NO和桔青霉细胞壁诱导子诱发紫杉醇合成的信号分子.     

一氧化氮对拟南芥保卫细胞内向钾通道的作用

研究了一氧化氮(NO)对拟南芥保卫细胞内向钾通道的作用. 当细胞内液不含钙的络合剂EGTA(Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)时, NO抑制内向钾通道电流; 当细胞内液含有EGTA时, NO对内向钾通道电流没有明显作用. NO还抑制拟南芥叶片气孔的开放; 当NO和EGTA共同处理叶片时, 气孔开放与对照相比不受抑制. 先前有报道NO能激活保卫细胞质膜钙通道. 由此推测, NO通过激活质膜钙通道引起胞内钙含量升高, 从而抑制内向钾通道电流, 抑制气孔开放.     

一氧化碳诱导绿豆下胚轴不定根的发生

研究了一氧化碳(CO)在绿豆下胚轴插条不定根发生中的调控作用. 结果表明, 与NO相类似, CO供体高铁血红素(Hematin)以浓度和时间依赖性诱导绿豆下胚轴的不定根发生, 不同浓度的CO气体饱和溶液也具有诱导作用. 此外, CO清除剂血红蛋白(Hb)和合成专一性抑制剂ZnPPIX, 抑制生长素极性运输的NPA以及一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME均能不同程度地逆转CO供体对绿豆下胚轴不定根发生的诱导作用; CO处理36 h后NO荧光信号有明显的增强趋势, 并主要分布在维管束, NO专一性清除剂cPTIO对CO诱导的NO荧光有抑制作用, 推测CO可能主要通过NOS途径来合成NO, 进而诱导绿豆下胚轴的不定根发生.     

MAP激酶调节蚕豆保卫细胞中ABA诱导的H2O2产生

已知许多蛋白激酶及蛋白磷酸酶参与了ABA诱导的气孔关闭信号转导过程, 而H2O2是ABA信号转导链的下游信号成分.运用表皮条生物学分析和激光共聚焦扫描技术, 研究促细胞分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)对蚕豆保卫细胞中ABA诱导H2O2产生的调节作用.用MEK1/2专一抑制剂(PD98059)处理蚕豆叶片的下表皮, 抑制了ABA诱导保卫细胞内H2O2的产生和气孔关闭.ABA和H2O2诱导气孔关闭后, 再用PD98059处理, 可以使关闭的气孔重新开放, 与之相对应的是PD98059使ABA诱导的、已增强了的H2O2探针荧光强度降低.而且PD98059不能阻断水杨酸诱导的H2O2的产生及其气孔的关闭, 因此, MEH1/2调节ABA诱导保卫细胞中H2O2产生和积累具有专一性.总之, PD98059通过抑制ABA诱导的H2O2的产生并清除其积累而阻断了ABA诱导的气孔关闭.因此, MAPK的激活在保卫细胞H2O2信号的产生、放大及其专一性应答信号刺激的反应中有着重要的调节作用.     

气孔运动中pH 对保卫细胞壁弹性模量的影响

保卫细胞壁的特性对气孔运动有重要的影响. 以前的研究多集中于保卫细胞壁的解剖结构, 对气孔运动中保卫细胞壁物理性质的改变了解很少. 本研究以蚕豆叶片表皮条为材料,运用细胞压力探针技术, 对气孔运动中不同pH下的保卫细胞壁弹性模量(ε)进行了测量. 研究发现, 当pH 从8.60 降至6.50 时, 保卫细胞壁的弹性模量从7.098 Pa 降至5.690 Pa. 气孔运动中, 较低的保卫细胞壁弹性模量有利于保卫细胞改变体积, 进而有助于气孔运动的完成. 从保卫细胞通过调控细胞壁pH 改变细胞壁弹性模量的角度来分析气孔运动机理, 对于完善气孔运动机理假说, 进而深刻理解气孔运动, 具有重要的意义.     

Ca2+/CaM参与乙酰胆碱调控气孔运动的信号转导

动物神经递质乙酰胆碱也存在于植物中并参与气孔运动调控. Ca²⁺/CaM在气孔保卫细胞信号转导中作为第二信使起着重要的作用. 药理学实验证明, 在含Ca²⁺的介质中, Ca²⁺通道阻断剂尼群地平及异博定(NIF, Ver)和CaM抑制剂三氟拉嗪(TFP)及W7抑制乙酰胆碱诱导的气孔开放, 但在含K⁺的介质中不起作用, 推测Ca²⁺/和CaM参与了乙酰胆碱调控气孔运动的信号转导.     

MAP激酶调节蚕豆保卫细胞中ABA诱导的H2O2产生

已知许多蛋白激酶及蛋白磷酸酶参与了ABA诱导的气孔关闭信号转导过程, 而H₂O₂是ABA信号转导链的下游信号成分. 运用表皮条生物学分析和激光共聚焦扫描技术, 研究促细胞分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)对蚕豆保卫细胞中ABA诱导H₂O₂产生的调节作用. 用MEK1/2专一抑制剂(PD98059)处理蚕豆叶片的下表皮, 抑制了ABA诱导保卫细胞内H₂O₂的产生和气孔关闭. ABA和H₂O₂诱导气孔关闭后, 再用PD98059处理, 可以使关闭的气孔重新开放, 与之相对应的是PD98059使ABA诱导的、已增强了的H₂O₂探针荧光强度降低. 而且PD98059不能阻断水杨酸诱导的H₂O₂的产生及其气孔的关闭, 因此, MEH1/2调节ABA诱导保卫细胞中H₂O₂产生和积累具有专一性. 总之, PD98059通过抑制ABA诱导的H₂O₂的产生并清除其积累而阻断了ABA诱导的气孔关闭. 因此, MAPK的激活在保卫细胞H₂O₂信号的产生、放大及其专一性应答信号刺激的反应中有着重要的调节作用.     

一氧化氮介导非亲和性激发子诱发水稻悬浮细胞过敏反应

98-186-1G1与97-23-2D1分别是水稻“秀水”品种的非亲和性与亲和性稻瘟病小种. 由98-186- 1G1细胞壁制备的激发子称为非亲和性激发子(IE), 可以诱导“秀水”悬浮细胞的过敏反应, 包括NO产生、PAL酶活性的升高、抗性相关基因pal, pr1与chi转录强度的增加以及水稻的过敏性死亡. 而由97-23-2D1细胞壁制备的激发子称为亲和性激发子(CE), 它不能有效地诱导“秀水”悬浮细胞NO水平的升高以及上述抗性相关基因转录水平的提高. 一氧化氮合成酶(NOS)的抑制剂L-NAA, PBITU以及NO的猝灭剂CPTIO可以抑制IE诱导的细胞过敏性死亡、PAL酶活性增加以及抗性相关基因转录强度的增加. NO的供体SNP直接处理“秀水”悬浮细胞也可以诱导pal, pr1与chi的转录. 这些结果表明, NO可以作为一种信号分子介导IE诱导的“秀水”过敏反应, 而且只有NO与H₂O₂联合作用才能介导IE诱导的过敏性死亡.     

酪氨酸蛋白磷酸酶参与保卫细胞中ABA诱导产生H2O2的信号传递

酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPases)在动物细胞的信号转导中起着非常重要的作用, 但是人们对其在植物细胞中的功能却了解甚少. 在ABA调控气孔运动的信号转导中, H₂O₂和MAPK都是非常关键的下游信号组分, PTPases是MAPK的重要的调节因子, 而MAPK调节保卫细胞中ABA诱导H₂O₂的产生. 本研究结果表明, PTPases专一性抑制剂PAO不仅阻止ABA或H₂O₂诱导的蚕豆气孔关闭, 也可以使ABA或H₂O₂诱导关闭的气孔重新张开, 说明PTPases可能在H₂O₂的下游调节ABA诱导的蚕豆气孔关闭过程. PAO和H₂O₂都可以有效抑制蚕豆表皮细胞PTPases的活性, 加入还原剂DTT不能减弱PAO对PTPases的抑制作用, 但可以解除H₂O₂对PTPases的抑制作用, 即H₂O₂可使PTPases发生可逆失活. PAO也可抑制ABA诱导的蚕豆保卫细胞中H₂O₂的产生. 推测PTPases不仅可以通过调控MAPK来影响ABA诱导的蚕豆保卫细胞中H₂O₂的产生, 而且还可能作为H₂O₂信号分子的感受因子, 进一步放大和传递信息, 参与调节气孔的运动.     

寻找植物的通气孔

气孔就是植物与外界环境之间进行气体交换的通道,主要位于植物体叶片的表面,除了叶片之外,刚长出的幼茎上也有一些气孔分布。单个的气孔非常小,是两个特殊形态的细胞（即保卫细胞）以及由其围绕形成的开口的总称。     

气孔开放时保卫细胞液泡中某些高聚物解聚对渗透调节的作用

电子显微镜观察显示: 蚕豆(V. faba L)叶片气孔开放前后, 保卫细胞液泡(GCV)中颗粒的平均体积下降了约3个数量级, 而分布密度增加了约2个数量级. 同时用激光共聚焦显微术的荧光比值法对气孔开放过程的跟踪测定说明, 在第1个可分辨的气孔开放动作前10 ~ 30 s时GCV的pH有一个约-0.5单位的变化, 一个快速的气孔开放过程紧随其后, 在约100 ~ 200 s的时间内达到稳定的约12 μm的开度. 提出了一个由-ΔpH变化诱导的与GCV 内某些高聚物解聚有关的渗透调节模式. 该模式所描述的渗透调节过程避免了传统“化学渗透”假说所依赖的耗能巨大的逆浓度梯度的跨膜运输, 是对气孔运动的多元调控假说的补充, 同时也为植物中其他快速运动机理的研究拓宽了思路.     

植物保卫细胞中毒蕈碱型乙酰胆碱受体的定位

动物神经传导中的递质乙酰胆碱（ACh)在植物的许多生理过程中起重要作用,但关于植物中乙酰胆碱受体的研究较少。用绿色荧光物质BODIPY FL标记的高亲和性配体ABT对气孔保卫细胞的毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR)进行定位研究。发现该受体存在于蚕豆和豌豆的保卫细胞质膜上,蚕豆保卫细胞内部显示出特异的荧光标记,推测该受体可能存在于保卫细胞叶绿体膜上,mAChR在保卫细胞上的定位为ACh调控气孔运动提供了新的可能的信号转导途径。