神经退行性疾病相关蛋白的翻译后修饰

特定靶蛋白的翻译后修饰对其执行细胞功能有重要作用,是细胞对生长、分化和应激等信号刺激所产生的调节功能的一种反应.翻译后修饰包括磷酸化修饰、乙酰化、甲基化、泛素化、类泛素化等不同的修饰.在神经退行性疾病的研究中,翻译后修饰对疾病的发生和病理影响日益受到人们的重视,我们对磷酸化、泛素化和类泛素化(SUMO化)修饰与神经退行疾病的关系及本实验室的工作进行介绍.     

E3泛素连接酶Pellino蛋白的研究进展

Pellino蛋白是近年来新发现的一类E3泛素连接酶,通过靶蛋白泛素化介导蛋白降解、蛋白与蛋白的相互作用、蛋白质细胞定位以及信号传导.目前研究表明Pellino蛋白在固有免疫细胞和获得性免疫细胞中具有重要调控作用,与炎症和自身免疫密切相关.本文总结了近年来Pellino蛋白的表达与活性调控、介导的信号转导途径以及在免疫...     

RNA内切酶CPSF3受E3D泛素连接酶UBE3D调控

泛素化是泛素分子在系列特殊酶作用下,对靶蛋白进行特异性修饰的过程,该过程参与细胞周期、基因表达、信号传递等几乎一切生命活动的调控,近年来成为开发新药物的新靶点.泛素化研究中,确定E3泛素连接酶和其特异性底物之间的作用是研究的重点和难点,探索底物蛋白翻译后修饰命运,对于研究E3泛素酶的修饰类型具有指示性的作用.E3D泛素...     

番茄SlSL1重组蛋白的表达、纯化及体外泛素化活性检测

泛素化作为真核生物细胞内普遍存在且极为关键的蛋白质翻译后修饰,可以使被修饰的蛋白质发生降解,在植物生长发育、胁迫应答等方面发挥着重要作用。泛素化降解需要通过E3泛素连接酶特异性识别靶蛋白并对其进行修饰,因此E3连接酶在泛素化途径中起着决定性的作用。文章通过克隆番茄SlSL1基因编码序列、构建原核重组表达质粒,并利用诱导表达、亲和吸附纯化SlSL1重组蛋白,以此进行SlSL1的体外泛素化活性检测。SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,由所构建番茄SlSL1基因重组质粒纯化获得SlSL1蛋白;体外泛素化检测显示,SlSL1蛋白形成多聚化泛素条带,具有E3泛素连接酶活性,表明SlSL1可能在番茄的泛素化调控途径中发挥功能。     

拟南芥AtTR1对AtCPK28和AtCPK32的体外泛素化修饰研究

为了研究E3连接酶AtTR1和非生物胁迫应答的相关蛋白AtCPK28、AtCPK32之间关系,本文构建原核表达载体pET28a-AtCPK28和pET28a-AtCPK32,并在大肠杆菌中表达了AtTR1、AtCPK28和AtCPK32重组蛋白,利用亲和层析纯化相应融合蛋白.将AtCPK28和AtCPK32蛋白分别加入含有ATP、泛素、E1、E2和AtTR1的体外泛素反应体系中,western blot检测到AtCPK28和AtCPK32有多聚泛素化条带,说明AtTR1在体外能多泛素化修饰AtCPK28和AtCPK32.结果表明AtCPK28和AtCPK32可能是AtTR1调控植物抗逆信号中的下游靶蛋白.     

蛋白酶体激活因子REGγ的肿瘤相关靶蛋白研究进展

蛋白酶体激活因子REGγ属于蛋白酶体激活因子REG(又名11 S)家族的成员之一,主要是通过激活20 S蛋白酶体以非泛素化和非ATP依赖的方式降解蛋白质.近年来,越来越多的研究表明,REGγ在多种肿瘤中出现了异常表达并与肿瘤的发生发展密切相关.REGγ主要是通过降解多种靶蛋白并调控相关的信号通路参与肿瘤的发生发展.本文综述了REGγ在肿瘤中发挥作用的靶蛋白,旨在进一步了解REGγ参与肿瘤发生发展的机制并揭示其作为人类多种肿瘤的诊断标志物和治疗靶点的潜在可能性.     

溴氰菊酯胁迫下小菜蛾泛素化蛋白的分析与鉴定

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western Blot和LC MS/MS技术,对在溴氰菊酯胁迫下的小菜蛾(Plutellaxylostella)四龄幼虫的泛素化蛋白(Ubiquitinated protein)的组分进行分析,结果表明小菜蛾溴氰菊酯敏感品系与小菜蛾溴氰菊酯抗性品系里的泛素化蛋白表达量有显著差异.本实验成功证明了在药剂胁迫下小菜蛾泛素化蛋白存在表达上的差异,该研究结果为分析昆虫细胞中泛素的功能及其对昆虫生理、生化和环境胁迫等方面的调节作用提供了参考.     

泛素-蛋白酶体途径的生物学功能

泛素—蛋白酶体途径通过降解许多诸如细胞周期因子、调节蛋白等蛋白,从而参与调节许多重要的生命活动。此途径的失调与许多人类疾病有关。针对此途径的研究为人类疾病预防和治疗提供了一个新思路。     

乙型肝炎病毒促进肝细胞PD-L1蛋白表达机理

为了研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)能否借助肿瘤细胞的抗免疫机制来逃逸机体免疫,利用HBV感染去肝细胞,研究受感染后的肝细胞对宿主免疫应答的变化.通过实时荧光定量PCR的方法分析HBV感染后的肝细胞内Axin和PD-L1的转录水平,发现HBV不影响Axin和PD-L1的转录水平,采用蛋白免疫印迹技术发现HBV能下调肝细胞内Axin蛋白水平,同时上调PD-L1蛋白水平.进一步在细胞内转染表达HBV的组成蛋白的质粒,通过蛋白免疫印迹技术发现HBV的组成蛋白HBx能下调细胞内Axin蛋白的表达.通过数据相关性分析以及泛素化实验发现,Axin能通过增加PD-L1的E3泛素连接酶SPOP的表达,促进PD-L1泛素蛋白酶体降解.进一步对PD-L1的泛素化方式进行探讨,发现Axin促进PD-L1的K48依赖的泛素化降解作用.结果表明,HBV可能通过HBx下调Axin和SPOP蛋白水平,抑制PD-L1泛素化降解,进而逃逸宿主免疫应答.本研究揭示了HBV免疫逃逸新机制,为治疗HBV奠定了新的基础,在一定程度上推动了抗HBV药物开发.     

组蛋白去甲基化酶LSD1的结构和功能研究进展

组蛋白去甲基化酶LSD1的发现是表观遗传学领域的重要进展,揭示了组蛋白赖氨酸甲基化和其他化学修饰如乙酰化、磷酸化、泛素化等一样是一个动态调节的过程.结构和功能研究显示 LSD1调控着基因转录的激活和抑制以及p53的活性,在癌症的发生和发展中起着重要的作用,是一个潜在的抗癌药物开发靶蛋白.     

油菜中—未知BnRCH蛋白的E3连接酶活性分析

利用本实验室前期以ATP6为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选到的一个N端含有RINGv结构(RING-variant)的蛋白,暂命名为BnRCH,构建GTK-BnRCH表达载体在原核细胞E.coli BL21(DE3)中高效表达GST-BnRCH融合蛋白,并将纯化的融合蛋白加入体外泛素反应体系,发现BnRCH在ATP、泛素、E1、E2存在的条件下,能催化多聚泛素化形成,具有E3连接酶活性.     

油菜中一未知BnRCH蛋白的E3连接酶活性分析

利用本实验室前期以ATP6为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选到的一个N端含有RINGv结构(RINGvariant)的蛋白,暂命名为BnRCH,构建GTKBnRCH表达载体在原核细胞E.coli BL21(DE3)中高效表达GSTBnRCH融合蛋白,并将纯化的融合蛋白加入体外泛素反应体系,发现BnRCH在ATP、泛素、E1、E2存在的条件下,能催化多聚泛素化形成,具有E3连接酶活性.     

小麦TaUBC基因泛素结合酶活性分析

已报道的RNA水平研究表明TaUBC可能是小麦产量相关基因,生物信息学分析显示该基因属于泛素结合酶家族.荧光定量PCR显示TaUBC在小麦根茎叶中均有表达.为了验证TaUBC蛋白是否具有泛素结合酶活性,本文利用原核系统表达野生型TaUBC及三种点突变TaUBC~(C21S)、TaUBC~(C85S)、TaUBC~(C107S)蛋白,并对这些蛋白进行体外泛素化活性分析.结果证实TaUBC是一个有活性的泛素结合酶.另外,点突变C85S使得TaUBC丧失E2活性,C21S和C107S则对活性没有影响,证明其UBC结构域中第85位Cys是结合泛素的关键作用位点.     

D-box附近泛素化位点突变对Cdc20介导的Sp100蛋白降解的影响

前期的研究发现Cdc20介导Sp100通过泛素-蛋白酶体途径降解,Sp100中的D-box在底物识别过程中具有重要作用.尽管在PML和DAXX中都存在典型的D-box序列,但是这两种蛋白都不能被Cdc20所识别.本研究中,我们构建了一系列含D-box的Sp100截断体来探讨Cdc20底物识别的必要序列.研究发现GFP-Sp100(152-182)截断体包含D-box但是不能被APC/C-Cdc20降解.GFP-Sp100(151K→G)突变潜在泛素结合位点后,Sp100降解显著受到抑制.远离D-box的潜在泛素化位点(217K,219K,225K)破坏后对Sp100降解没有影响.我们的结果表明,Sp100蛋白中D-box附近泛素化位点(151K)在Cdc20介导的蛋白降解中是必要的.     

hASB-8相互作用蛋白的初步研究

hASB-8基因是对肿瘤细胞生长具有明显抑制作用的人类新基因．其编码蛋白属于人ASB蛋白家族中的一个成员,与小鼠中的ASB-8蛋白同源性达96％．保守结构域分析显示hASB-8在N端包含4个Ankyrin repeats,在C端包含了一个SOCS box．利用酵母双杂交技术,筛选了人的胎盘(Placenta)cDNA文库,获得了与KASB-8相互作用的2个蛋白,Elongin C和CDK4 binding protein;并在二倍体酵母体内进行了验证．这些试验提示hASB-8蛋白可能介导肿瘤细胞中靶蛋白和泛素复合体之间的相互作用,并与肿瘤细胞靶蛋白转录调节有关．     

胃癌耐药相关hsa-miR-194-5p的靶基因预测及生物信息学分析

目的：研究胃癌耐药相关hsa-miR-194-5p的靶基因，并分析其参与的生物学过程和信号转导通路，为胃癌耐药机制的表观遗传学研究提供前期基础.方法：通过NCBI数据库检索hsa-miR-194-5p的基本信息；使用预测数据库预测hsa-miR-194-5p的靶基因；使用DAVID数据库对靶基因集合进行功能富集分析(GO)和信号转导通路富集分析(KEGG).结果：成熟的miR-194-5p序列多个物种之间具有高度保守性.预测靶基因共325个，参与的生物学过程主要有Golgi组织和细胞对DNA损伤刺激的反应(P<0.01),分子功能包括泛素蛋白连接酶结合和泛素介导的蛋白水解(P<0.01),细胞组分富集在细胞核和细胞表面，调控包括TGF-β和WNT等多条信号转导通路(P<0.01).结论：miR-194-5p的靶基因SMURF1、 RAC1、MAPK1与胃癌细胞的增殖密切相关.     

棉铃虫泛素基因的克隆及序列分析

泛素介导的泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是真核细胞内依赖ATP的非溶酶体蛋白质降解途径,该途径对细胞内蛋白的选择性降解起着重要作用.设计一对简并引物,从棉铃虫Helicoverpa armigera卵巢细胞Ha831中克隆了泛素基因的编码区,GenBank登录号AY456195.序列分析表明,该编码区的长度为228bp,编码76个氨基酸、其编码蛋白的相对分子质量为8 560,等电点为6.56.同源性比较发现,棉铃虫泛素基因与其他真核生物泛素基因在氨基酸水平上具有96%以上的相似性,而与棉铃虫核多角体病毒泛素的相似性为76%,所有已知的泛素关键功能位点在该泛素蛋白中均保守存在.     

泛素-蛋白酶体途径的组成及其生物功能

泛素-蛋白酶体途径(UPP)是20世纪70年代末期新发现的一种细胞内蛋白降解途径,在多种蛋白质降解中发挥重要作用,具有高度特异性。UPP介导的细胞蛋白降解是一个复杂、缜密的调控过程。UPP可识别、标记、进而降解那些被泛素化的蛋白质。它在抗原提呈、细胞周期、NF-kB代谢等方面发挥重要调控作用,而且UPP的异常与许多疾病如肿瘤、脓毒症、骨骼肌损伤等的致病机制有关。就UPP的组成、作用机制及其功能进行综述。     

川陈皮素潜在药效靶标预测及多维药理作用分析

目的预测中药活性成分川陈皮素的潜在靶标并进行分子对接验证,探讨其多维药理作用。方法运用反向分子对接服务器PharmMapper将川陈皮素与2241个人类蛋白靶标分别对接,选取Normalized Fit Score打分值前15的靶蛋白,采用Systemsdock Web Site平台对具有疾病治疗价值的主要靶蛋白进行正向分子对接验证。结果川陈皮素与成纤维细胞激活蛋白(Seprase)、网织红细胞-4受体(Reticulon-4 recoptor)、组织蛋白酶L2(CathepsinL2)3个靶蛋白结合较好,对接分数分别为5.215、5.227、6.090。靶蛋白药效团模型与川陈皮素分子特征一致,分子对接显示川陈皮素与靶蛋白核心氨基酸有相互作用。结论川陈皮素与Seprase、Reticulon-4 recoptor、CathepsinL23个重要靶蛋白结合强度较好,具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等药理作用。     

SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp2上调A549细胞泛素水平并被泛素化修饰研究

目的 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）因其强大的感染力肆虐全球,因此深入研究病毒与宿主的相互作用是揭示SARS-CoV-2致病机制的重要途经。方法 利用同源重组方法 将SRAS-CoV-2的非结构蛋白Nsp1～Nsp16构建到真核表达载体上,并通过Western blot检测Nsp1～Nsp16重组质粒的蛋白表达情况。接着使用Western blot检测Nsp2对细胞总泛素水平的影响,并通过细胞免疫荧光检测Nsp2在细胞中的分布情况。最后通过免疫共沉淀技术对Nsp2与泛素之间的相互作用关系进行检测。结果 Western blot检测显示Nsp1～Nsp16重组质粒能够在A549细胞中正常表达;筛选发现非结构蛋白Nsp2能在细胞质中上调细胞总泛素表达水平;免疫共沉淀检测进一步发现Nsp2能与泛素蛋白发生相互作用。结论 成功构建了SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp1～Nsp16真核细胞表达载体,并发现非结构蛋白Nsp2可以增加细胞总泛素表达水平并被泛素化修饰。提示Nsp2通过泛素途径参与到SARS-CoV-2与宿主的相互作用,有助于深入了解病毒与宿主的作用机制。