小鼠CD47-Fc融合蛋白表达载体构建、表达纯化及其生物学活性研究

构建CD47重组蛋白真核表达载体pcDNA3.1(-)-CD47-Fc.在真核细胞293T中成功表达重组蛋白,经亲和层析获得较高纯度重组蛋白CD47-Fc.通过免疫荧光染色、流式细胞技术和细胞黏附实验测定重组蛋白CD47-Fc的生物学活性,结果显示制备的CD47-Fc蛋白可与腹腔巨噬细胞表面的SIRPα很好地相互作用,制备的CD47-Fc具有较高的生物学活性.     

外泌体包裹的miR-19b抑制EV71复制的影响

[目的]探讨外泌体包裹的miR-19b对EV71病毒复制的影响,为EV71病毒的miRNA防治药物的开发提供参考.[方法]将游离的miR-19b-cy3.5分子和转染miR-19b-cy3.5的HT29细胞分泌的外泌体分别处理T98G细胞,观察进入细胞的效率;分别提取未处理的、转染mimic-n.c.和转染miR-19b的HT29细胞分泌的外泌体,并给予T98G细胞孵育后,检测细胞内miR-19b的表达;分别以60 mg/L转染mimic-n.c.的HT29细胞分泌的外泌体、60 mg/L和40 mg/L转染miR-19b的HT29细胞分泌的外泌体孵育T98G细胞并感染EV71病毒,检测病毒RNA载量;将携带包裹的miR-19b-cy3.5的HT29细胞来源的外泌体,通过尾静脉注射小鼠检测miR-19b在小鼠各个器官中的表达.[结果] miR-19b-cy3.5能够通过外泌体的形式进入T98G细胞中,而游离的miR-19b-cy3.5无法进入细胞;转染miR-19b的HT29细胞分泌的外泌体在处理T98G细胞后,胞内miR-19b高表达,同时,外泌体处理后的T98G细胞中EV71病毒R...     

穿心莲内酯对S180小鼠体内抗肿瘤作用的研究

观察穿心莲内酯对小鼠移植性肿瘤S180生长的抑制作用,并探讨其可能的机制.采用MTT法检测穿心莲内酯对体外培养的S180细胞增殖的抑制作用;建立小鼠移植瘤模型,采用荷瘤小鼠抑瘤率检测穿心莲内酯对小鼠肉瘤S180的体内抗肿瘤作用.以对荷瘤小鼠免疫器官质量,巨噬细胞对中性红的吞噬率,巨噬细胞产生TNF-α的影响评价穿心莲内酯对小鼠免疫功能的作用.结果穿心莲内酯能够剂量依赖型的抑制体外培养的S180细胞的增殖;25、50 mg/kg的穿心莲内酯对移植性动物肿瘤S180的抑瘤率分别为45.27%和56.87%,对荷瘤小鼠脾脏和胸腺质量无明显的影响.经穿心莲内酯刺激后,小鼠巨噬细胞对中性红的吞噬功能明显地增强,并能显著刺激巨噬细胞分泌TNF-α.说明穿心莲内酯具有明显的体内抗肿瘤作用,其抗肿瘤活性是通过抑制肿瘤细胞的生长,激活小鼠巨噬细胞两方面共同产生的.     

急性胰腺炎患者血清外泌体在NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡中的作用机制研究

为了探究急性胰腺炎血清外泌体对于NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡的作用机制.首先选取2021年1月至2023年1月苏州大学附属第一医院收治的85名急性胰腺炎患者为研究对象,根据急性生理与慢性健康状况II(APACHE-II)评分分为轻症组45例和重症组40例,两组患者外周血中NLRP3表达采用蛋白质印记检验,IL-1β和IL-18浓度采用ELISA检验,表面分子CD63和TSG101的水平采用流式法检验.结果表明:与轻症组相比,重症组患者APACHE-II评分显著升高,外周血NLRP3蛋白表达、IL-1β和IL-18浓度、CD63和TSG101水平均上升,且NLRP3蛋白表达与急性胰腺炎患者的APACHE-II评分呈正相关.在细胞层面,以AR42J细胞作为对照组,取急性胰腺炎重症组患者外周血分离后的外泌体与AR42J细胞共培育作为外泌体共培育组,比较两组细胞的NLRP3、caspase-1、caspase-4、caspase-5、Cleaved-Caspase11、GSDMD-FL和GSDMD-N表达、细胞上清中IL-1β和IL-18浓度.结果表明:与对照组相比,外泌体共培育组细胞的N...     

三阳血傣的体外抗肿瘤活性与免疫调节研究

采用MTT法分别测定三阳血傣(SYKT)及其组成的8味中药对人体肿瘤细胞及正常细胞的抑制作用.采用免疫抑制小鼠模型,通过SYKT对小鼠免疫器官指数和腹腔巨噬细胞吞噬指数调节,研究其对免疫系统的影响.结果表明,SYKT中龙血竭和三七对肿瘤细胞有一定的抑制作用,且SYKT能显著抑制免疫功能低下小鼠的脾脏指数和胸腺指数的缩小;并增强巨噬细胞的吞噬指数.因此,三阳血傣本身对肿瘤细胞的抑制作用虽然不太显著,但其对免疫抑制模型小鼠却有显著的免疫功能恢复作用,所以SYKT的抗肿瘤活性源于对免疫系统的影响.     

α一干扰素、异搏定协同逆转肾癌细胞药物耐受性

目的：探讨α-干扰素(α-IFN)、异搏定(VRP)对RCC-925肾癌细胞阿霉素敏感性的影响。方法：(1)将RCC-925肾癌细胞分别与不同浓度的逆转剂α-干扰素或异搏定或α-干扰素+异搏定及与不同浓度阿霉素(ADM)共同培养;MTT法检测肿瘤细胞的存活率。(2)图像分析仪检测逆转前后PgP(P-glycoprotein)表达。结果：单独应用α-干扰素无逆转作用;联合应用α-干扰素、异搏定显著逆转肿瘤细胞的耐药性,效果优于单用异搏定(P＜0．05);2．5 mg/L异搏定+500pg/mLα-干扰素共同与细胞作用后,PgP表达降低。结论：α-干扰素、异搏定作为逆转剂联合使用,能显著逆转RCC-925细胞的耐药性,可望为临床耐药肿瘤的治疗提供一种新的方法。     

猪α干扰素在BHK-21细胞中的表达与生物活性分析

为了构建猪α-干扰素(PoIFN-α)的真核表达系统,鉴定其生物学活性,分离猪的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增猪α-干扰素基因序列,克隆至pcDNA3.1(+)载体,并转染BHK-21细胞。通过G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用real-time PCR及ELISA测定PoIFN-α基因在BHK-21细胞内的表达,利用淋巴细胞增值试验(MTT)检测表达蛋白的生物学活性。结果表明:稳定整合PoIFN-α基因的BHK-21细胞系其PoIFN-αmRNA的转录效率比阴性对照组提高1.52倍,蛋白表达量显著提高1.35倍。MTT试验表明真核表达PoIFN-α淋巴细胞增值活性与阴性对照组相比差异显著(P<0.01),表明BHK-21细胞表达的PoIFN-α具有良好的生物学活性,为开发新型抗病毒制剂奠定基础。     

人CSNK1A1基因两种转录变异体CK1αLS与CK1αS在细胞株中的表达

目的:分析CSNK1A1基因两种转录变异体CK1αLS和CK1αS在人正常细胞株和人肿瘤细胞株中的表达及在肿瘤发生发展中的作用.方法:RT-PCR法半定量检测不同细胞株中CSNK1A1基因的CK1αLS与CK1αS的mRNA表达水平.结果:36个细胞株中有32个细胞株存在CK1αLS与CK1αS的表达差异.在胚肾细胞2...     

氰戊菊酯对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

通过加入PD98059(细胞外信号调节激酶阻断剂)后探讨氰戊菊酯诱导乳腺癌细胞增殖的作用机制.观察加入PD98059前后氰戊菊酯诱导的细胞增殖情况,采用MTT法,流式细胞仪测定周期法,流式细胞仪法观察ERα蛋白、ERK蛋白和p-ERK1/2蛋白表达情况.氰戊菊酯能够明显升高MCF-7细胞的S期细胞数,作用程度与雌二醇相似,并且通过降低ERα蛋白表达量,升高p-ERK蛋白表达量促进MCF-7细胞的增殖;加入PD98059后,S期细胞比例降低,ERα蛋白表达量升高,p-ERK蛋白表达量降低,MCF-7细胞的增殖降低.氰戊菊酯通过ERK细胞信号转导通路发挥促细胞增殖作用.     

凋亡素融合蛋白在HeLa细胞中的转导及体外活性分析

研究胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)的肝素结合域(HBD)在HeLa细胞中的转导活性,并证实HBD具有运载药物蛋白(凋亡素)进入细胞并诱导肿瘤细胞凋亡的能力。通过克隆表达的HBD-EGFP融合蛋白经Ni2+-NTA纯化后,观察其转导活性;并利用HBD-凋亡素融合蛋白表达纯化后,用噻唑蓝(MTT法)检测肿瘤细胞的凋亡。结果表明:用荧光显微镜可观察到HeLa细胞内有绿色荧光;MTT法检测表明凋亡素融合蛋白能诱导HeLa细胞的凋亡;HBD具有转导活性,能携带药物蛋白(凋亡素)进入细胞并能诱导HeLa细胞的凋亡。     

绞股蓝多糖的抗肿瘤作用及其机制研究

通过建立小鼠移植瘤模型,采用荷瘤小鼠抑瘤率检测绞股蓝多糖对小鼠肉瘤S180的体内抗肿瘤作用;采用MTT法检测绞股蓝多糖对体外培养的肿瘤细胞增殖的抑制作用.此外,采用比色法测定了绞股蓝多糖对巨噬细胞吞噬率和产生细胞因子NO的影响;采用ELISA法测定了绞股蓝多糖对巨噬细胞产生IL-1β和TNF-α的影响. 绞股蓝多糖可明显抑制移植性动物肿瘤S180的生长,并呈明显的剂量依赖关系;经绞股蓝多糖刺激后,小鼠巨噬细胞对中性红的吞噬功能明显的增强,并能显著刺激巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β.为绞股蓝多糖的进一步开发提供了实验数据.     

海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株,利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后,台盼蓝染色测定细胞存活率,稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor, MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示：对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调,但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比,突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后,细胞存活率和胞内CFU上升,吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加,分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示,embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力,但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过...     

蜜环菌β-1,6-葡聚糖通过调节人源巨噬细胞极化发挥抑制结肠癌作用

以人源巨噬细胞THP-1诱导的M2型巨噬细胞为模型,研究从蜜环菌中分离纯化出的β-1,6-葡聚糖(AAMP-A70)对其极化影响,并分析AAMP-A70通过调节巨噬细胞极化抑制结肠癌细胞DLD-1增殖的作用及机制.采用酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测AAMP-A70处理前后THP-1诱导的M2型巨噬细胞中M1型和M2型巨噬细胞标志物表达情况;将各处理组的细胞培养液处理DLD-1细胞,通过MTT和结晶紫染色检测DLD-1细胞的增殖情况;并通过Western-blot实验检测DLD-1细胞的凋亡蛋白表达情况.实验结果表明：AAMP-A70可显著下调M2型巨噬细胞标志物VEGF,Arg-1,TGF-β的表达,促进M1型巨噬细胞标志物TNF-α,IL-1β,CCR7的表达;AAMP-A70处理组细胞的培养液可显著抑制DLD-1的增殖,且呈浓度依赖趋势;AAMP-A70处理组的细胞上清液可诱导DLD-1细胞中表达的cleaved-PARP和cleaved-Caspase-3上调.     

LR2和TLR6在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用

[目的]建立鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体6(TLR6)在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用,为阐明鸟分枝杆菌致病机制提供依据。[方法]用鸟分枝杆菌感染U937细胞,于感染0 h、8 h、16 h、24 h和48 h后分别提取细胞总蛋白,并通过Western blot方法检测TLR2和TLR6的表达;分别提取细胞培养上清液,利用ELISA技术检测肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化情况。用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,通过Western blot方法分别检测其促凋亡因子BAX和抗凋亡因子BCL-2的表达量,用ELISA技术检测细胞培养上清液中TNF-α含量变化情况,用流式细胞仪检测U937细胞的凋亡变化。[结果]鸟分枝杆菌感染U937细胞可引起TLR2、TLR6和TNF-α表达上调;用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,可使U937细胞内促凋亡因子BAX和TNF-α表达量下降(P<0.05),抗凋亡因子BCL-2表达量升高(P<0.05),并可以明显降低感染鸟分枝杆菌后的细胞的凋亡率(P<0.05)。[结论]TLR2和TLR6与巨噬细胞凋亡相关,巨噬细胞通过TLR2和TLR6来识别鸟分枝杆菌,而鸟分枝杆菌反过来通过促进TLR2和TLR6的表达来影响巨噬细胞相关凋亡通路,从而诱导巨噬细胞凋亡。     

龙葵浓缩汁对小鼠细胞免疫功能的影响

目的了解龙葵浓缩汁对小鼠细胞免疫功能的影响.方法用3种浓度的龙葵口服液,即高剂量(3 000 mg/kg体质量),中剂量(1 500 mg/kg体质量),低剂量(750 mg/kg体质量)连续灌胃不同组别小鼠,28 d后分别采用Jerne改良玻片法进行小鼠的抗体生成细胞检测试验;MTT法进行小鼠的淋巴细胞转化实验;乳酸脱氢酶测定进行小鼠NK细胞活性测定试验.结果小鼠抗体生成细胞数、NK细胞活性在高剂量组与对照组间比较有显著性差异(P<0.05),中、低剂量组与对照组间比较无显著性差异(P>0.05);吞噬率、吞噬指数及淋巴细胞的增殖能力在低、中、高剂量组与对照组间比较均无显著性差异(P>0.05).结论高剂量的龙葵浓缩汁能明显增加小鼠的抗体生成细胞数,增强小鼠NK细胞的活性;而龙葵浓缩汁对小鼠巨噬细胞吞噬功能及对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化的能力无影响.     

TLR2和TLR6在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用

【目的】建立鸟分枝杆菌感染巨噬细胞模型,探讨Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体6(TLR6)在鸟分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用,为阐明鸟分枝杆菌致病机制提供依据。【方法】用鸟分枝杆菌感染U937细胞,于感染0h、8h、16h、24h和48h后分别提取细胞总蛋白,并通过Western blot方法检测TLR2和TLR6的表达;分别提取细胞培养上清液,利用ELISA技术检测肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化情况。用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,通过Western blot方法分别检测其促凋亡因子BAX和抗凋亡因子BCL-2的表达量,用ELISA技术检测细胞培养上清液中TNF-α含量变化情况,用流式细胞仪检测U937细胞的凋亡变化。【结果】鸟分枝杆菌感染U937细胞可引起TLR2、TLR6和TNF-α表达上调;用鸟分枝杆菌感染阻断TLR2和TLR6后的U937细胞,可使U937细胞内促凋亡因子BAX和TNF-α表达量下降(P0.05),抗凋亡因子BCL-2表达量升高(P0.05),并可以明显降低感染鸟分枝杆菌后的细胞的凋亡率(P0.05)。【结论】TLR2和TLR6与巨噬细胞凋亡相关,巨噬细胞通过TLR2和TLR6来识别鸟分枝杆菌,而鸟分枝杆菌反过来通过促进TLR2和TLR6的表达来影响巨噬细胞相关凋亡通路,从而诱导巨噬细胞凋亡。     

能量可控陡脉冲对荷瘤大鼠免疫功能的影响

采用细胞悬液注射法建立Wistar大鼠皮下瘤模型,研究能量可控陡脉冲(ECSP)对荷瘤大鼠免疫功能的影响.ECSP处理后利用MTT法检测各组大鼠脾淋巴细胞转化率及NK细胞活性,ELISA法检测大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的表达.结果表明ECSP处理组肿瘤生长明显受到抑制;ECSP处理组淋巴细胞转化率、NK细胞活性及TNF-α的表达明显高于荷瘤对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.05),且与正常对照组相似(P=0.953,P=0.130,P=0.080).ECSP可以抑制肿瘤生长,诱发机体抗癌免疫反应,改善和恢复荷瘤鼠淋巴细胞和巨噬细胞的免疫活性.     

人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定

目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.     

灰树花胞外多糖的分离纯化及免疫调节作用

通过对灰树花(Grifola frondosa)深层发酵的胞外多糖(EXGFP)进行分离纯化,研究其性质和免疫活性.灰树花胞外粗多糖经醇沉、酶–sevag脱蛋白和Sephadex G-100色谱柱分离得到纯化组分EXGFP-A.通过Sepharose 4B凝胶柱法和HPLC法鉴定EXGFP-A的纯度,结果表明EXGFP-A是均一多糖组分,纯度为92.68%,.理化性质实验结果表明,EXGFP-A是一种非淀粉类、不含糖醛酸及多酚类物质,含有α–D–葡萄糖苷键和吡喃糖环的中性多糖.MTT实验表明,当EXGFP-A质量浓度为80,μg/m L、作用48,h时,小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞增殖指数达到最大值,为137.5%,.吞噬活性实验结果证实EXGFP-A能够提高RAW264.7细胞对中性红的吞噬能力,扫描电子显微镜结果发现RAW264.7细胞经过EXGFP-A处理后,细胞表现出了明显的活化特征.     

黄精多糖对环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制的影响

目的:探究黄精多糖对环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制的拮抗作用.方法:采用MTT法体外评价了黄精多糖对正常小鼠脾细胞的增殖活性,用环磷酰胺制备了小鼠体免疫抑制模型,并分别测定了小鼠脾脏、胸腺指数,脾脏、胸腺细胞的体外增殖活力,巨噬细胞吞噬功能,巨噬细胞分泌炎性细胞因子的能力.结果:黄精多糖能显著提高正常小鼠脾细胞增殖活力,当剂量大于200μg·m L~(-1)时,协同Con A增殖促进率在700%以上;黄精多糖能提高免疫功能低下小鼠的脾脏和胸腺指数,促进Con A刺激下的脾脏和胸腺细胞增殖,增强巨噬细胞的吞噬功能和IL-6和TNF-α的分泌.与模型组比较,高剂量黄精多糖给药组(150 mg·kg~(-1))小鼠脾脏指数增加了79.0%,协同Con A刺激指数增加了43.3%;胸腺指数升高了148.3%,协同Con A刺激指数升高48.5%.结论:黄精多糖能显著缓解环磷酰胺所致的小鼠免疫抑制.