重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( )中构建重组表达质粒pET25b ( )/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.     

重组大豆KUNITZ型胰蛋白酶抑制剂Tid的大肠杆菌表达及抑制活性研究

利用大肠杆菌高效表达系统表达大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SBTi—A2)Ti^d,并利用亲和层析的方法纯化得到有抑制胰蛋白酶活性的SBTi^d．对重组SBTi^d的pH稳定性和温度稳定性与天然SBTi^d进行了比较研究.结果表明重组SBTi^d在高pH下具有更好的稳定性,预示了SBTi^d作为生物农药或利用转基因方法提高作物抗虫性的应用前景．     

萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

本研究从萨尔瓦多型银合欢(Leucaena leucocephala cv.Salvador)种子中分离纯化出一种新的胰蛋白酶抑制剂,即萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白抑制剂(Trypsin Inhibitor from Leucaena leucocephala cv.Salvador seeds,LlsTI).成熟的种子经粉碎,生理盐水浸提之后,经CM-Sepharose阳离子交换层析得到LlsTI纯品.该胰蛋白抑制剂为19.8kDa的单体蛋白.其N末端测序结果为KGSYLRDVRG,而其内部则含有一段KTAPLVVGFLK的序列,与已知的蛋白酶抑制剂序列都不同,表明LlsTI为一种新的胰蛋白酶抑制剂,同时也含有一部分与已知Kunitz型抑制剂相保守的碱基.LlsTI对胰蛋白酶的摩尔抑制比近似为1∶1.其对于胰蛋白酶属竞争性抑制剂,其Ki值为2.77×10-10 M.LlsTI对胰蛋白酶的抑制活力表现出对高温和pH变化较高的耐受性.但其活性受100mM DTT影响.本研究对LlsTI对其它丝氨酸类蛋白酶的抑制作用也做了测定,其中只有胰蛋白酶的活性受到了抑制.根据圆二色谱的分析结果,LlsTI是一种αβ蛋白,其二级结构在室温下的水和缓冲液Tris-HCl(pH7.5)中组成相似.     

胰蛋白酶抑制剂的药用功能

胰蛋白酶抑制剂是具有抑制胰蛋白酶作用的一类物质.该类物质的来源不同,其活性和作用的酶也不同.基于对近几年国内外相关文献的分析,综述了其多种临床应用功能,说明胰蛋白酶抑制剂是人类重要的药物资源.     

中国野生大豆胰蛋白酶抑制剂的初步研究

采用分离提取,电泳回收,ＰＡＧＥ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,亲和电泳和抑制活性测定等方法,对我国一年生和多年生野生大豆种子蛋白中的胰蛋白酶抑制剂进行了初步研究。在４５°Ｎ来源一的上生野生大豆中得到纯化的胰蛋白酶抑制剂。通过电泳迁移率,分子质量,末端分析和抑制活性等测定,证明中ＳＢＴｉ－Ａ２的Ｔｉ＾ｂ型。     

章鱼内脏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

通过热处理、硫酸铵盐析、膜超滤及SP-Sepharose 离子交换层析,从章鱼内脏中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂 (Octopus Trypsin Inhibitor ,OTI)．Tricine-SDS-PAGE 电泳结果显示,OTI的分子质量约为6500 u．性质分析结果表明:OTI在pH=1.0~11.0缓冲液中孵育30 min,抑制活性稳定;在100 ℃下加热1 h、2 h 后仍分别具有90% 和65% 的抑制活性,具有良好的pH值稳定性和热稳定性;OTI能够显著抑制胰蛋白酶的活性,对胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶几乎无抑制活性;OTI能够有效抑制蓝圆鲹肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶 (MBSP) 引起的肌球蛋白降解．     

大豆胰蛋白酶抑制剂的制备与性质测定

用DEAE-纤维素柱层析分级洗脱,从大豆中分离出三种胰蛋白酶抑制剂。以BAEE作底物,测得三种组份对胰蛋白酶的抑制程度为16.6％、25.0％和100％。三种抑制剂的分子量分别为20000、21000和12000,等电点是pH3.4、pH2.7和pH4.5。     

重组绿豆胰蛋白酶抑制剂片段对肠癌细胞SW480迁移的影响

探讨重组胰蛋白酶抑制剂活性片段(LysGP33)的抗肠癌效应.大肠杆菌原核表达LysGP33活性片段,GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化.MTT比色和细胞划痕方法检测LysGP33活性片段对SW480细胞增殖和迁移的影响.结果表明:10 μmol/L LysGP33活性片段对SW480细胞的增殖活性无明显影响,但能够有效地抑制SW480细胞的迁移,并呈现时间依赖效应.绿豆胰蛋白酶抑制剂抑制了肠癌细胞的迁移,在抗肿瘤浸润和转移中具有一定的应用前景.     

补骨脂胰蛋白酶抑制剂的亲和层析分离纯化和部分性质

本文介绍牛胰蛋白酶—对氨基苯砜乙基(ABSE)—Sepharose—4B的制备,及用此亲和吸附剂分离提纯补骨脂胰蛋白酶抑制剂的过程。用该方法对补骨脂胰蛋白酶抑制剂粗提物进行分离,可获得电泳单点纯样品。经SDS—PAGE电泳测定,该抑制剂的分子量为55000。等电聚焦电泳测定其等电点为pⅠ6.6,Chiff试剂染色为阴性。氨基酸组成分析結果表明含12种氨基酸,其中Gly、Glu含量最高。     

大豆KUNITZ型胰蛋白酶抑制剂的稳定性及抗虫性研究

大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂（SBTi-A2)存在于种子中，2种kunitz型胰蛋白酶抑制剂Ti^a和T^1d得到纯化，并对它们的pH稳定性和温度稳定性进行了比较研究，而且通过人工饮料喂养鳞翅目昆虫棉铃虫来研究SBTi-A2的抗虫性，结果显示，棉铃虫的幼虫喂食含有Ti^a的人工饲料后，表现出生长延缓、体重减轻、羽化率降低、死亡率增加，由此显示了SBTi-A2作为生物农药及利用转基因方法使作用提高抗虫性的应用前景。     

从五十种药用植物筛选胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂的生理作用,除保护生物体的一些组织不被胰蛋白酶水解外,对生物的受精~(1)、胚胎的发育~(2)、血液的凝固及抗凝固~(3)都有密切的关系。近年来已发表了胰蛋白酶抑制剂对多种疾病的影响~(4)及其在动物实验和临床治疗研究方面的综合报导~(5)。胰蛋白酶抑制剂作为药物应用有着广阔的前景。目前,对来源于动物的胰蛋白酶抑制剂的研究比植物的多且详细,但其含量极微。植物来源的胰蛋白酶抑制剂的研究也多限于豆科植物的种子。中国医药学是一个伟大的宝库,中草药的种类繁多、来源丰富。本研究的目的是从中草药筛选和提取胰蛋白酶抑制剂,研究其理化性质及生理活性,从而说明其药理作用。本文报导了从五十种药用植物筛选出入种含有胰蛋白酶抑制剂的物质,为今后的进一步研究打下基础。     

具有抑制糖苷酶和胰蛋白酶双重活性的亚麻多肽的大肠杆菌重组表达及其活性分析

亚麻胰蛋白酶抑制剂(Linum usitatissimum L.LUTI)是亚麻中一种兼具胰蛋白酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂双重活性的多肽。文章将LUTI基因连接在pGEX-6p-1载体上获得重组载体pGEX-6p-1-LUTI,转化至大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)表达,经GST-Sepharose4B、Prescission Protease酶切GST标签、Sephacryl S-200凝胶层析,获得分子量大小为8kDa电泳纯的重组LUTI(rLUTI)。经抑制活性测定,相比天然的LUTI,rLUTI对胰蛋白酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性明显提升。二硫键存在与否对两种酶的抑制活力均有影响。利用定点突变技术获得rLUTI的C4/A,C49/A,C4、49/A突变体,进一步双酶抑制活性及CD结构分析显示,rLUTI的C4/A、C49/A及C4、49/A突变体对胰蛋白酶抑制活性影响尤为明显,α-葡萄糖苷酶的抑制活性略微下降;其中rLUTI的C49/A及C4、49/A突变体完全丧失了对胰蛋白酶的抑制活性。C4/A的突变对rLUTI的二级结构影响最为明显,导致α螺旋结构含量的降低。以上结果表明rLUTI第4位氨基酸Cys是影响其二级结构的关键位点,第49位氨基酸Cys则在维持其双酶抑制活性上发挥着重要作用,特别在胰蛋白抑制活性方面尤为突出。     

大豆胰蛋白酶抑制剂及其临床应用

胰蛋白酶抑制剂是具有抑制胰蛋白酶作用的一类物质,能够参与调节体内许多重要的生命活动过程。本文介绍了大豆胰蛋白酶抑制剂结构、生理功能及其临床应用方面的研究进展。     

一个麻风树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定

通过PCR技术克隆得到一个麻疯树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因(JcKTI)的开放阅读框序列(540bp),对应的基因组序列不含内含子.该序列编码一个含有179个氨基酸残基的成熟多肽,其在根和茎中的表达最高,在叶片和种子中较低.原核表达的重组蛋白显示出一定的抑制牛胰蛋白酶的活性,过表达该基因的转基因烟草蛋白提取物对胰蛋白酶具有一定抑制作用,同时转基因烟草叶片可使进食后的棉铃虫幼虫生长发育受阻,摄食量减少.上述结果暗示JcKTI基因可能在麻疯树根和茎的抗虫应答中扮演着一定的角色.     

赤小豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质研究

用酸抽提、2.5％TCA热处理、硫酸铵盐析、凝胶层析和DEAE纤维素离子交换层析等方法,从中药赤小豆中分离得到一种胰蛋白酶抑制剂。聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一谱带。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,其分子量为7400。N-末端分析和氨基酸组成测定结果表明,赤小豆胰蛋白酶抑制剂不含半胱氨酸和胱氨酸,是以酪氨酸为N-末端,由54个氨基酸残基组成的单一多肽链。它仅对胰蛋白酶有较强的抑制作用,对胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶均无明显的抑制活力,对热及酸碱亦较稳定。     

抑制癌细胞生长复合物

台湾生化研究人员发现一种新的复合蛋白质,可有效地抑制癌细胞生长,经在动物身上实验,结果效力显著。这种复合物是由白凤豆凝集素和相思子胰蛋白酶抑制剂制成的。白凤豆凝集素是从白凤豆种子中提炼出的一种特殊的亲糖蛋白质,它的毒性比一般亲糖蛋白低,但对癌细胞的凝集力和亲合力     

眉豆胰蛋白酶抑制剂的研究

一、引言动植物体内常含有胰蛋白酶抑制剂。通过数种药用豆的筛选比较,我们发现眉豆中含有较丰富的胰蛋白酶抑制剂。国内外对豆类来源的胰蛋白酶抑制剂的研究相当普遍,深入,但有关眉豆胰蛋白酶抑制剂的研究尚未见报导。     

补骨脂胰蛋白酶抑制剂的提取及其特征

前文~(1)我们报道了从五十种中草药中筛选出补骨脂、黑豇豆、天花粉等八种含有胰蛋白酶抑制剂的活性植物物质。本文报道补骨脂胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其一些特性。材料和方法(一)实验材料及其预处理1.补骨脂购自省医药采购供应站。将补骨脂装入索氏提取器,用氯仿抽提六小时,风干后粉碎,经80目筛筛分备用。2.胰蛋白酶新疆伊犁地区肉联厂生化制药厂产品。3.羊胰蛋白酶结晶品。上海生化所东风试剂厂产品。(二)底物及试剂     

马铃薯蛋白酶抑制因子特性的研究

本文研究了马铃薯蛋白酶抑制因子的稳定性及其对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制能力,结果表明：该抑制因子对胰蛋白酶活性的抑制作用较弱,最大抑制程度为６５％;对胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用较强,抑制程度最高可达９５％以上,并且,它对ｐＨ及温度的变化均具有较强的稳定性．     

Caspase-3抑制剂的筛选体系构建及药物筛选

Caspase-3是细胞凋亡途径中重要的靶蛋白,研究Caspase-3抑制剂或激活剂,对治疗心脑血管疾病、肿瘤等具有积极意义.利用原核表达系统高效表达Caspase-3,并以表达的粗酶构建基于Caspase-3抑制剂的体外高通量筛选模型,随后对实验室保存的960种放线菌次级代谢产物进行筛选,获得9株具备分泌Caspase-3抑制剂活性的菌株,随后进一步复筛,确认了2株具备分泌高活性的Caspase-3抑制剂的菌株pwh890和pwh891,均可抑制80%的Caspase-3活性.最后对pwh890分泌的次级代谢产物进行初步分离纯化,获得31.3mg纯度较高的抑制剂,为后续的抑制剂的结构解析和改造奠定基础.