苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建和对烟草的转化

将苜蓿花叶病毒中国分离株(Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，A1MV-Ch)的复制酶P2亚基(90 kD蛋白)基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROKⅡ中，得到重组植物表达载体pAIMV-FL．用三亲融合法导入农杆菌LBA4404，并转化烟草，经PCR检测，获得了含全长cDNA的转基因烟草植抹．     

用聚合酶链式反应扩增抗冻肽基因并在双元表达载体中克隆

抗冻肽基因导入植物的第一步合成了５＇－末端分别带有限制性酶ｘｂａＩ和ＫｐｎＩ识别位点的一对引物，以美洲拟鲽抗冻肽的ｃＤＮＡ克隆为模板，用锚定聚合酰酶链反应扩增了抗冻肽基因，并克隆到细菌表达载体ｐＧＥＭ３２ｆ（一）和植物表达盒式载体ｐＧＡ６４３中，以限制性酶切分析和菌落杂交技术证明了转化子质粒ＤＮＡ中的含有抗冻肽基因，又用ＰＣＲ方法扩增了转化子的抗冻肽基因，从而证实了克隆成功。     

毛尖紫萼藓GpPOD基因克隆及其表达载体的构建

本实验室已成功构建毛尖紫萼藓干旱胁迫cDNA文库。从中选取与抗旱相关的过氧化物酶基因,命名为GpPOD。通过RACE技术克隆获得序列全长。采用RT-PCR方法克隆GpPOD基因,连接到pMD-18T simple载体上,构建克隆载体pMD18T-GpPOD,将其插入表达载体PRI101-AN中,构建表达载体PRI101-GpPOD,然后将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中。重组质粒pMD18T-POD、PRI101-POD的DNA测序结果与原序列相似性高达99%,证明GpPOD基因成功连接到pMD-18T simple载体上,并已克隆到表达载体PRI101-AN中;农杆菌转化后的PCR电泳图谱在约581 bp左右得到清晰条带,证明重组质粒PRI101-GpPOD已成功转入农杆菌中。本实验为后续研究GpPOD基因的遗传转化奠定了良好基础。     

天山雪莲PsbO基因的克隆、原核表达及其烟草中的遗传转化

从已建立的天山雪莲抗寒cDNA文库中筛选克隆了雪莲的PsbO基因,发现该基因全长1145bp,编码329个氨基酸。通过构建原核表达载体在大肠杆菌中成功获得表达,同时构建了植物表达载体,转化烟草,并获得了部分转基因植株。     

花生白藜芦醇合酶基因转化单子叶植物表达载体的构建

构建了花生白藜芦醇合酶基因(RS)转化单子叶植物的表达载体,该表达载体含有ubi 启动子和内含子,能启动该基因在单子叶植物中高效地表达.通过PCR反应扩增出目的片段,连接到克隆载体Pubi35s上,切下含ubi和RS约3 000 bp的片段连接到植物表达载体pCAMBIA-1 380上.经PCR和酶切检测,结果与预期相同,经测序确定插入片段读码框正确.该表达载体可用于单子叶植物高效的表达.     

角化细胞生长因子的获得及植物表达载体的构建

从鼠肺中提取RNA,设计相应的引物,经RT PCR扩增出角化细胞生长因子cDNA序列;插入pMD18 T载体,经DNA测序证实为KGF基因.将KGF基因经酶切后连接于植物CaMV35S启动子和NOS终止子之间,单酶切插入pBI1301植物双元表达载体,转化大肠杆菌,阳性克隆提取质粒后转化农杆菌EHA105,实现KGF植物表达载体的构建,为KGF的进一步研究奠定基础.     

马尾松银松素合酶基因转化双子叶植物表达载体的构建及鉴定

以马尾松为材料,在获得马尾松银松素合酶基因的基础上,构建了该基因转化双子叶植物的表达载体,该表达载体含有35S启动子和NOS终止子,能启动基因在双子叶植物中高效地表达.设计并合成分别含有Bgl和BstE酶切位点的上下游引物,通过PCR反应扩增出含有该酶切位点的银松素合酶基因cDNA全序列,酶切后连接到pCAMBIA1301植物表达载体上.经PCR鉴定、酶切分析及DNA测序证实cDNA片段大小、序列以及读码框的正确性.最后通过电击将表达载体转化农杆菌LBA4404,为进一步研究银松素合酶基因的功能奠定基础.     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

棉花脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆、原核表达与纯化

为进一步探讨脱氢抗坏血酸还原酶的生物学功能,克隆棉花的脱氢抗坏血酸还原酶基因,对该基因进行了原核表达,并对重组蛋白进行纯化和分析。通过RT-PCR方法扩增脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,利用BamH I和Xhol I酶切位点将其克隆至组氨酸(histidine,His)融合蛋白表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(isopropy--βD-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物,并用亲和层析柱纯化重组表达的pET28a-DHAR蛋白。结果表明:重组体PET28a-DHAR经测序和酶切鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE分析目的蛋白高效表达,相对分子量为26 kD左右,并获得了纯化的His-DHAR融合蛋白。     

转APX基因烟草抗旱能力研究

用毛白杨中克隆得到的抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因,构建植物表达载体pBI121-APX,将pBI121-APX载体用农杆菌介导法转化烟草,成功得到转基因烟.PCR、PCR-Southern的结果表明,APX基因已经成功的整合到转基因烟草基因组中.干旱实验结果表明,与对照相比较,转基因烟草表现出较强的抗旱性.     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.     

pQE30-bgln原核表达质粒的构建和鉴定

构建重组原核表达质粒pQE30-bgln使之可以在大肠杆菌中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以克隆质粒pUCP67为模板,用降落PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln).利用原核表达载体pQE30构建pQE30-bgln重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后序列情况.PCR结果显示扩增片段2.2 kb,与预期相同.重组质粒酶切后显示其大小约5.6kb,大小及酶切图谱与预期相同.经测序发现插入片段读码框正确.可用于原核表达的pQE30-bgln质粒构建成功.     

蚯蚓抗菌肽40 kD Fetidin基因的原核表达与复性

40 kD的fetidin是存在于蚯蚓体腔液中的一种具有较好抗菌活性的蛋白.为了获得大量fetidin,从蚯蚓(Eisenia fetida)中调取fetidin的基因,分别克隆到pKW32和pMXB10中,构建了融合和非融合表达载体,并转化大肠杆菌进行诱导表达.结果无论是融合还是非融合表达,产物均以包含体形式存在.融合表达产物通过亲和层析获得复性,复性产物对粘质沙雷氏菌具有抗菌活性.     

大麦醇溶蛋白基因片段克隆和RNAi植物表达载体构建

 为了降低啤酒大麦蛋白的含量,提高啤酒大麦品质,利用甘肃推广面积最大的品种甘啤4号为材料,克隆大麦醇溶蛋白基因保守区序列,构建RNAi表达载体。根据已知大麦醇溶蛋白基因保守序列设计一对特异性引物B2PF5′-CAACCATTTCCACAGCAACCACCAT-3′,B2PR5′-GAAAGATAGAGTAGACGATTGCACG-3′,采用PCR技术从甘啤4号大麦基因组中获得了1个349bp片段（GP4）。依据载体pHANNIBAL和pART27的结构,分别将GP4按所对应酶切位点正反向插入,利用热激法转化。结果分析显示,克隆出的片段与GenBank （NCBI）中醇溶蛋白基因核苷酸序列同源性高达92%,所构建成的RNAi表达载体pART27-pHAN-GP4中含目标片段。     

La多肽的基因克隆和表达

以人脾ｃＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ获得Ｌａ多肽（全长）的ＤＮＡ片段。将此片段利用双酶定向克隆到ＭＢＰ（麦芽糖结合蛋白）融合系统的载体ｐＭＡＬＴＭ－ｃ中得以表达。经免疫印迹实验证明，表达后的产物具有Ｌａ多肽的特异性，敏感性则超过生化制备的ＥＮＡ制品。     

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术,克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因——3-酮酯酰．ACP合成酶基因（Kas）上游400bp的调控区域．将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草．GUS组织化学染色表明,克隆到的440bp片段具有启动子活性．对该片段进行序列分析发现,在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box,分别为-316～-311位的TATAAA和-224～-219位的TATAAA;在TATA-box上游还存在1个位于-378～-374处的CAAT-box,序列为CCAAT．该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成,提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础．     

哈萨克族食管癌中Survivin基因启动子区CpG岛真核表达载体的构建

 食管癌的形成与多种基因的异常表达有关,哈萨克族食管癌的发病又有其独特的机制。克隆并研究早期相关基因的启动子区CpG岛可为进一步揭示其发病机制奠定基础。本研究构建Survivin基因启动子区CpG岛真核表达载体,探讨其甲基化在新疆哈萨克族食管癌中的作用。通过Primer 5.0设计软件设计引物,采用常规PCR法从新疆哈萨克族食管癌患者的基因组DNA中扩增出Survivin基因启动子区CpG岛,CpG岛与真核表达载体pCAT3 promoter经HindⅢ单酶切后,连接试剂盒将二者连接并转导入甲基化酶缺陷的大肠杆菌E. coli ER1793中扩增。DNA测序证明获得Survivin基因启动子区CpG岛,并成功克隆入真核表达载体pCAT3 promoter中。     

依纽小单胞菌2-脱氧蟹肌醇合成酶基因的克隆与表达

从伊纽小单孢菌(Micromonospora inyoensis)扩增参与紫苏霉素生物合成的2-脱氧蟹肌醇合成酶基因sisB,并分别将其克隆到筛选载体pUC18和表达载体pET-30a上,其开放阅读框长1 185 bp,编码含394个氨基酸残基(41.94 ku)的多肽链,将pET-sisB转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),使sisB基因实现表达.基因sisB的碱基序列与棘孢小单孢菌(M.echinospora)的基因gntB的碱基序列的同源性高达93%.预测的SisB蛋白序列与GntB蛋白序列的同源性为95.2%.基因sisB是继紫苏霉素抗性基因srm1(AY661430)和参与紫苏霉素生物合成的糖基转移酶基因sisD(DQ250992)和sisZ(DQ250994)后,从依纽小单孢菌克隆到的又一新基因.该基因在GenBank的接受号为DQ250993.     

胰岛自身抗原GAD65片段和胰岛素B链基因共表达DNA疫苗的构建与表达

构建两种胰岛自身抗原谷氨酸脱羧酶（ glutamic acid decarboxylase, GAD） 65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗,并检测其在体外COS-7细胞中的表达。PCR方法从GAD65质粒中扩增出GAD190-385和GAD490-570两个片段的cDNA,overlap法再分别与信号肽基因进行拼接,将拼接后的融合基因SGAD190-515和SGAD490-570分别与胰岛素B链基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCFA．1中。重组质粒经酶切和测序鉴定后,脂质体体外转染COS-7细胞,Western blot方法检测目的基因在该细胞中的表达。结果表明核酸序列测定克隆的融合基因和胰岛素B链基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western blot显示转染了DNA疫苗的COS-7细胞中均可检测两个目的基因的表达。两种GAD65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗均成功构建,为自身免疫糖尿病的免疫干预研究奠定了实验基础。