克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列设计引物,以pHBM102为模板,扩增得到β-1,4-内切葡聚糖酶GluD基因片段,克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pHBM905上,获得重组毕赤酵母表达载体pHBM905D,将此质粒分别转化毕赤酵母GS115,KM71和SMD1168菌株,筛选获得GS115(pHBM905D),KM71(pHBM905D),和SMD1168(pHBM905D),平板诱导培养表明,GS115(pHBM905D)所产生的水解圈最大,酶活力最高.摇瓶诱导培养,表达β-1,4-内切葡聚糖酶,此酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值6.4,在诱导8 d后酶活力达到最高为0.185 8 U/mL.     

枯草芽孢杆菌寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的表达研究

根据枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因序列设计引物,以pHBM003为模板,扩增得到寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因,克隆至毕氏酵母（Pichia pastoris）表达载体pHBM905上,获得重组毕氏酵母表达载体pHBM9053．将此质粒分别转化毕氏酵母GS115、KM71和SMD1168菌株,筛选获得重组毕赤酵母GS115（pHBM9053）、KM71（pHBM9053）和SMD1168（pHBM9053）;然后进行摇瓶诱导培养,这3株毕氏酵母分别在诱导培养60h、48h和24h后,酶活力达到最高,对应为2．233u／mL、0．34u／mL和1．235u／mL;GS115（pHBM9053）所产寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的最适反应温度为75℃,最适反应pH值为6,在30～75℃、pH8～9范围内较稳定．     

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因(appA)全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因(appA-P),并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20~50℃、pH1.0~6.0范围内较稳定.     

天蚕素A-蜂毒素杂合肽基因表达载体的构建及其分泌表达

根据天蚕素A(cecropin A,CA)N端第1-8个氨基酸残基和蜂毒素(melittin,ME)N端第1-18个氨基酸残基,用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的杂合肽CA(1-8)ME(1-18)基因.DNA序列分析表明,合成的基因与设计的一致.该基因插入毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中,置于AOX I启动子的控制下,并通过电转化将重组质粒pPIC9K-came导入Pichiapastoris SMD1168宿主菌,在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子,转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达,发现Tricine-SDS-PAGE有明显条带.比浊法初步测定表明,表达产物came对E.coli DH5α具有抗菌活性.     

α-1,6-葡聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

根据朱黄青霉(Penicillium minioluteumHI-4)α-1,6-葡聚糖酶的基因序列,人工合成α-1,6-葡聚糖酶基因并将其插入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZαA,PCR和双酶切验证结果均表明成功构建了重组质粒pPICZαA-Dex.重组质粒经SacⅠ线性化后整合到毕赤酵母X33基因组中进行表达.摇瓶发酵表明,重组毕赤酵母经甲醇诱导120 h产酶活力达到最高值29.2 U/mL,SDS-PAGE结果显示在67 ku附近有明显的条带,与α-1,6-葡聚糖酶理论分子质量相符合.     

温度和光照对心里美萝卜生殖生长期α-淀粉酶表达的影响

为了研究温度和光照在生殖生长期,对心里美萝卜α-淀粉酶活性和同工酶谱带的影响,对萝卜进行了不同种植时间以及不同过冬方式的处理,并在生殖生长期的不同时间对萝卜肉质根和叶片中的α-淀粉酶活性进行了测定,同时采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对不同时期各个器官中的α-淀粉酶同工酶谱进行了分析.研究结果表明,低温和光照增加α-淀粉酶活性,α-淀粉酶同工酶谱带存在器官表达差异和时间表达差异,并与光照和温度有关.由此结论萝卜生殖生长期α-淀粉酶的表达受温度和光照影响.     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合及高效表达

从中温α-淀粉酶生产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)264中克隆得到中温α-淀粉酶基因(amy L)并构建了重组表达质粒p AX01-amy L。该质粒转化枯草芽孢杆菌264后利用同源重组机制将由木糖操纵子引导的amy L表达盒整合入枯草芽孢杆菌染色体的lac A位点,以增加中温α-淀粉酶基因的拷贝数。经淀粉平板产酶初筛及Southern blot鉴定,成功分离获得了可高效分泌表达中温α-淀粉酶的基因工程菌ZHWY。该菌株在摇瓶发酵75 h后α-淀粉酶酶活可达到730 U/m L,比酶活为156 U/mg总蛋白,与原始菌株264相比提高了70%,且继代过程中表达水平稳定。在5 L发酵罐中,枯草芽孢杆菌ZHWY发酵所产中温α-淀粉酶酶活最高达到1450 U/m L,具有良好的工业应用前景。     

融合胸腺素α1的猪干扰素α在毕赤酵母中的表达及效价测定

猪干扰素α(IFN-α)是在特定条件下由细胞产生的一种具有广谱、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白,胸腺素α1(Tα1)是一种具有免疫调节的活性肽.本研究中将Tα1基因与去掉信号肽序列的猪IFN-αN端融合,构建酵母表达载体PHBM-Tα1-IFNα,同时构建单独表达IFNα的重组质粒PHBM-IFNα,重组质粒电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,甲醛诱导表达.利用SDS-PAGE法检测融合蛋白的表达,并用细胞病变抑制法测定干扰素的效价.实验结果表明,酵母表达上清中IFNα的效价为2.916×10~6U/m L;Tα1-IFNα的效价为2.860×10~7U/m L,该结果证实胸腺素α1可提高融合表达蛋白猪干扰素的活性,因此,通过酵母表达体系获得高活性胸腺素-猪干扰素融合蛋白,可为高效、低成本获得抗病毒药物提供一种新的模式.     

法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明:法夫酵母对20μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

嗜碱芽孢杆菌耐热耐碱内切木聚糖酶基因的密码子优化及在毕赤酵母中的表达

【目的】研究极端耐热耐碱的木聚糖酶,使其能够满足造纸行业中碱性高温的苛刻环境。【方法】将一种来源于嗜碱芽孢杆菌S7的耐热耐碱内切木聚糖酶基因(xyn10A)密码子进行优化,基因合成后克隆至pHBM905BDM载体上,并转化毕赤酵母GS115菌株。【结果】木聚糖酶基因(xyn10A)优化后与原始序列比对相似性为76.70%。基因合成后克隆到pHBM905BDM载体上,并成功转化毕赤酵母GS115菌株。通过交联木聚糖底物平板水解圈法初筛及摇瓶复筛得到一株产酶量较高的菌株,且其在摇瓶发酵第10天达到最高酶活力,为495U/mL。另外,糖基化分析表明该酶在毕赤酵母中表达时被糖基化修饰。【结论】密码子优化后的极端耐热耐碱木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。     

绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

 通过RT PCR从绿色木霉AS33711中克隆得到EG III基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉 eg3 的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2489,通过SDS PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明：转化子有明显的重组EG III表达带,能够产生CMC水解圈,说明 eg3 基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG III的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG III的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉 eg3 基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

采用RT-PCR 的方法从目前最高效的纤维素酶产生菌之一的绿色木霉AS3.3711中克隆得到纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因cbh2。序列测定和分析表明,该编码序列长1416 bp,编码472个氨基酸残基,与已公布的绿色木霉CICC 13038的cbh2仅在第263位存在一个氨基酸残基的差别（Gln替换为Pro）,而与里氏木霉VTT-D-80133的cbh2则完全同源。该序列已经提交GenBank,登录号为 DQ864992。利用信号肽预测软件SignalP 3.0发现该基因自身带有信号肽序列,其最大可能的切割位点在18和19位氨基酸残基之间。将该基因片段接入酿酒酵母高拷贝数整合型表达载体pScIKP中,得到重组表达质粒pScIKP-cbh2。经酶切线性化后电转化酿酒酵母AS2.489菌株,通过G418浓度梯度筛选出高抗转化子。转化子经蛋白电泳分析,发现该基因的信号肽序列能够被酿酒酵母识别,因此重组CBHⅡ成功分泌到了胞外。但可能由于酿酒酵母表达系统的过度糖基化作用,重组CBHⅡ比出发菌绿色木霉的CBHⅡ分子量要高许多,并且可能因为过度糖基化作用位点不同而形成了不同大小分子量的表达产物。转化子经CMC糖化力法测定酶活,发现该重组CBHⅡ酶活性并没有受过度糖基化作用的影响,最高可达7.71 U/mL,比大多数报道的要高。其作用的最适pH值为5.0,最适温度为65 ℃,且具有较好的热稳定性。     

地衣芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的Bacillus licheniformis植酸酶基因DNA序列(13eneBank AF469936),设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以地衣芽孢杆菌AB91062的总DNA为模板,扩增出了植酸酶基因phyL的编码区,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因编码区长1146bp,编码381个氨基酸,与已发表的Bacillus lichenjformis植酸酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有92％的同源性;在氨基酸水平上与已发表的衣芽孢杆菌植酸酶相似性为93％．并将该基因编码区克隆到大肠杆菌表达质粒pHBM625上,并在大肠杆菌中实现了高效表达,表达产物具有正常的生物学活性．     

人血管抑制素基因克隆、表达和生物活性分析

应用PCR技术从人胎肝cDNA库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GSll5，经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GSll5(pPIC8KA3)。再用G418筛选法，在含不同浓度的G418平板上筛选高拷贝整合的转化子。对高拷贝整合的转化子进行发酵培养和诱导表达。SDS—PAGE及Westem印迹分析显示：表达产物约占胞外蛋白的43％，相当于94mg/L，并具有免疫活性。并能抑制bFGF诱导的鸡胚尿囊膜新生血管的生成。还对用G418筛选高拷贝整合转化子的方法做了探索。     

Heterologous Expression of Mycobacterium tuberculosis AgSSB in Pichia pastoris

The DNA fragment encoding matureMycobacterium tuberculosis major secretory protein Ag85B was inserted into thePichia pastoris secretory expression vector pHBM905A, under the control of theAOX1 promoter. The recombinant plasmid pHBM905A-85B linearized bySal I was introduced intoPichia pastoris strain GS115 by PEG1000 transformation method. After phenotype screening and PCR identification, the resulting GS115-pHBM905A-85B strain was cultivated and induced with methanol. The recombinant Ag85B protein in secreted form was attained with molecular weight of 35×10³ approximately detected by SDS-PAGE and Western blot. ELISA experiment proved that the protein had good antigen specificity. Secretory expression of recombinantM. tuberculosis Ag85B inP. pastoris will open a door to mass production of the protein in heterologous host and allow ready evaluation of its immunological function. Foundation item: Supported by the Key Scientific and Technological Project of Wuhan(301121028) Biography: LIU Yan(1971-), female, Ph. D candidate, research direction: vaccine against tuberculosis.     

β葡聚糖酶杂合基因bglHAM的克隆及在P.pastoris中的表达

采用PCR的方法,以Bacillus macerans总DNA为模板,构建出β-1,3-1,4葡聚糖酶杂合基因bglHAM,与巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K重组,得到重组质粒pPIC9K-HAM,电脉冲转化法转化酵母菌GS115,KM71,在MM,MD平板上筛选表型,YPD-G418平板上筛选多拷贝重组子,重组菌株经甲醇诱导后,刚果红平板染色法检测到β-葡聚糖酶活性,SDS-PAGE证明表达产物的分子量约为24kD,摇瓶诱导培养筛选到的重组菌株,胞外每mL发酵液最高酶活达240U。     

T-DNA transfer and integration as a tool for insertional mutagenesis in the taxol-producing fungus

Agrobacterium tumefaciens-mediated DNA transformation method was applied to transform Nodulisporium sylviforme fusant HDF-68, a taxol-producing fungus. We constructed a binary vector pBI121-43 carrying a hygromycin-resistant gene cassette between the right and left borders of T-DNA. Optimal co-cultivation of N.sylviforme with A.tumefaciens containing pBI121-43 led to 110～130 hygromycin-resistant transformants per million conidia. Putative transformants were found to be mitotically stable. The molecular analysis of transformants demonstrated the random integration of single copy of the T-DNA into the host genome. This transformation system serves as a basic tool for insertional mutagenesis in N.sylviforme fusant HDF-68, and the development of such system lays a solid foundation for constructing high-yied gene engineering strain and clarifying taxol biosynthesis pathway in this fungus.