透明质酸合成酶2真核表达载体的构建及表达

构建了透明质酸合成酶2真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达。利用RT-PCR法从MG63细胞总RNA中扩增,获得人透明质酸合成酶2cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-N3,将经双酶切鉴定和DNA测序证实的阳性重组子命名为pEGFP-N3-HAS2。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。双酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pEGFP-N3-HAS2真核表达载体。转染HEK293细胞后可见HAS2-EGFP融合蛋白高表达并定位于浆膜。该载体的成功构建为进一步探讨透明质酸合成酶2在治疗骨性关节炎、修复关节软骨缺损中的应用价值奠定了基础。     

利用pGenesil-1.0构建人Dna2真核表达干扰载体

目的:构建人基因Dna2干扰(RNAi)的真核表达载体.方法:根据GenBank上人Dna2的cDNA序列设计并合成两条单链寡核苷酸,退火以后,插入质粒pGenesil-1.0多克隆位点的BamH I和Hind III之间进行重组,构建重组干扰载体,转化DH5α后测序鉴定出阳性菌株.重组质粒以脂质体法转染HeLa细胞,提取Dna2蛋白以免疫印迹法检验干扰效果.结果:设计的目的干扰序列5’-catagccagtagtattcgatg-3’可明显抑制Dna2在HeLa细胞的表达.结论:利用pGenesil-1.0构建的人Dna2干扰载体适用于该基因功能研究.     

GGT1基因的真核表达载体构建及其表达定位

构建GGT1重组真核表达载体,观察GGT1在COS7细胞中的定位.利用PCR技术扩增GGT1全长基因,经HindⅢ和EcoR Ⅰ酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体.将构建完成的重组表达质粒转染入COS7细胞,利用激光共聚焦显微镜观察GGT1在细胞中的定位.构建载体经双酶切和序列测定证实重组载体包含有正确的GGT1编码序列.激光共聚焦显微镜观察到,整个细胞内弥散绿色荧光,绿色荧光分布于COS7细胞浆中,提示GGT1定位于细胞浆中.成功构建人pEGFP-N1-GGT1真核表达载体,检测到GGT1定位于哺乳细胞的细胞浆中,为GGT1的功能研究提供了线索.     

真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyoD-HA-His的构建及功能检测

为了便于检测和纯化转染到非肌肉细胞的生肌因子MyoD,同时为能够与转染的其他生肌因子的表达量进行比较,将MyoD编码区克隆在真核表达载体pcDNA3.1(+)-HA-His。测序表明克隆的MyoD序列正确,并与标签序列构成一个开放阅读框;Western blot显示在起始密码子前添加kozak序列GCCGCCACC,可使融合蛋白能够以较高水平表达;生肌转化实验表明,融合蛋白MyoD-HA能够有效激活靶基因的表达。     

DJ-1真核表达载体构建及其转染口腔癌细胞的表达

目的:构建人DJ-1真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并转染人口腔癌细胞系Tca8113,建立含有DJ-1真核表达载体的口腔癌细胞模型。方法:以人HEK293细胞为模板,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增人DJ-1基因全长,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,经酶切鉴定和测序分析后,通过脂质体介导法转染人口腔癌细胞系Tca8113,并设立空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)和未转染组,最后采用RT-PCR法检测Tca8113细胞中DJ-1基因的表达情况。结果:RT-PCR法获得长度为500 bp左右的阳性产物,重组质粒后经酶切鉴定和序列分析证实真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1构建成功。转染Tca8113细胞后RT-PCR法证实与空质粒组和未转染组相比,转染真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1的细胞系中DJ-1基因表达明显增高。结论:成功构建人真核表达载体pcDNA3.1(+)/DJ-1,并建立含有该载体的口腔癌细胞模型,为进一步研究DJ-1基因在口腔癌中的功能及应用DJ-1进行基因治疗奠定基础。     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

pEGFP-N1/PDX1真核载体的构建与表达

目的: 构建胰腺十二指肠同源框蛋白1 (pancreatic and duodenal homeobox factor 1, Pdx1)转录因子真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达能力及其生物活性.方法:以人胚胎胰腺组织基因组的mRNA为模板经RT-PCR扩增获得Pdx1基因编码序列,克隆到真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点中,构建pEGFP-N1/Pdx1真核表达质粒,并转染L02细胞,用RT-PCR、免疫组化、间接荧光法和Western Blot检测目的基因表达情况.结果:酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确;RT-PCR检测目的基因Pdx1 mRNA在靶细胞L02中表达;免疫组化和间接荧光结果证实Pdx1主要存在于细胞核内;Western blot检测到细胞核内Pdx1目的蛋白.结论:完成人Pdx1基因克隆,成功构建了目的基因Pdx1真核表达载体,并在L02细胞中获得有效表达.     

斜纹夜蛾为害特点及防治

斜纹夜蛾原为一种间隙暴发为害的杂食性害虫,近年来在安徽省沿江等地发生频率和发生程度明显加大,全省每年发生面积均在30万公顷以上,在为害高峰期,大豆、十字花科蔬菜等作物上平均百株幼虫虫口数有几百甚至上千头,高的田块百株幼虫虫口数量超万头,尤其是大面积种植转基因抗虫棉(BT棉)地区,棉田斜纹夜蛾为害呈逐年加重的趋势,其发生为害水平远超过棉铃虫,已成为棉田主要害虫.     

鼠源VCAM-1真核表达载体构建及在同源细胞中过表达研究

构建鼠源VCAM-1基因的真核表达载体,并使其在C2C12细胞中过表达,为相关病毒受体研究奠定基础.采用RT-PCR方法扩增鼠源VCAM-1基因,构建重组载体pcDNA3.1-VCAM-1.通过脂质体法转染至C2C12细胞内;采用实时荧光定量PCR和Western-blot分别检测目的基因和蛋白的过表达情况.应用间接免疫荧光实验分析VCAM-1在细胞中的定位.构建的重组质粒pcDNA3.1-VCAM-1转染C2C12细胞后,实验组VCAM-1基因和蛋白表达均显著高于对照组细胞(P0.01),且主要表达定位于胞浆中.结果表明,实验成功地构建了鼠源VCAM-1真核表达载体,并在同源细胞中实现过表达.     

SINPV对斜纹夜蛾幼虫的侵染阈值

斜纹夜蛾核型多角体病毒（ＳＩＮＰＶ）对斜纹夜蛾幼虫的侵染阈值因温度和虫龄而异，虫龄愈大，温度愈高，则侵染阈值也愈大．在２０～４０℃内，３龄幼虫的侵染阈值为９０９０．９～６６６６６６．７ＰＩＢｓ／头，５龄幼虫为１３１５７８．９～７１４２８５．７ＰＩＢｓ／头．随温度升高，各龄幼虫的侵染阈值差异逐渐减少，接种量为２×１０６ＰＩＢｓ／头左右及高于２×１０７ＰＩＢｓ／头时，ＳＩＮＰＶ自身似有一定的协生作用和拮抗作用．作为病原体侵染阈值、致病性及寄主抗病性的指标，侵染阈值优于ＬＤ５０和ＬＣ５０，为解决病原体密度阈值的获取提供了一定的基础．     

日本蛇根草OjDFR5基因的克隆与真核表达载体的构建

二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性,是类黄酮代谢途径中的关键酶,对不同花青素的合成与积累起到决定作用,直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢黄酮醇4-还原酶的编码基因,OjDFR5,并对该基因的序列进行分析,同时将其与真核表达载体pBI121进行连接,获得真核重组表达质粒pBI121-OjDFR5,并将重组质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中。研究结果一方面为该基因的功能解析奠定基础,同时也为探究日本蛇根草类黄酮代谢机制研究提供基因资源。     

猪Motilin和Ghrelin基因克隆及其真核载体的构建与体外表达

目的:克隆Motilin和ghrelin基因,构建表达Motilin的pDsRed-Express-motilin载体和表达ghrelin的pEGFP-ghrelin载体,并检测它们能否在真核细胞中表达及表达量的变化。方法:用RT-PCR方法分别从猪小肠和胃的cDNA上扩Motilin和ghrelin基因片段,并分别克隆到pDsRed-Express-N1载体和pEGFP-N1载体上,用脂质体法转染RIBS2细胞系(来自于肾),并用半定量RT-PCR和荧光成像法检测目的基因的表达。结果:构建了表达Motilin的pDsRed-Express-motilin和表达ghrelin基因的pEGFP-ghrelin载体,并能在真核细胞中超表达目的基因,为进一步相关研究提供了实验基础。     

反义核酸Ⅷ C真核表达载体的构建及其对转化血管内皮细胞的影响

利用人工合成的部分反义核酸ⅧC(以pⅧC表示)用以构建含有部分反义凝血因子基因片段的真核表达质粒pXJ41-neo/pⅧC,再用磷酸钙介导转染血管内皮细胞,筛选出阳性克隆血管内皮细胞,扩大培养转基因细胞,用金黄色葡萄球菌凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转基因细胞ⅧC蛋白质的表达水平.结果表明所构件人工合成的部分反义核酸pⅧC真核表达载体能有效抑制人的凝血因子ⅧC的表达,因此建立了有效表达反义核酸pⅧC的血管内皮细胞模型.     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

pEGFP-IFI16表达载体构建及其表达对Hep-2细胞增殖的影响

RT-PCR扩增的IFI16基因连接到pUCm-T载体并测序鉴定,经测序正确的IFI16基因再连接到pEGFP-C1载体构建pEGFP-IFI16重组质粒,重组质粒pEGFP-IFI16转染Hep-2细胞后用荧光显微镜及半定量RT-PCR分析其表达情况,并用流式细胞仪测定细胞生长曲线分析其表达对Hep-2细胞增殖的影响.结果显示pEGFP-IFI16重组质粒构建正确,转染Hep-2细胞后荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,半定量RT-PCR结果显示转染后Hep-2细胞IFI16基因条带亮度明显升高,细胞生长曲线测定结果显示转染后Hep-2细胞从第二天起其增殖速度变慢、至第三天时其增殖速度明显慢于对照细胞的增殖速度.说明成功构建了能在Hep-2细胞中表达EGFP-IFI16融合蛋白的pEGFP-IFI16重组质粒,pEGFP-IFI16重组质粒体表达能抑制Hep-2细胞的增殖.     

TaNHX2基因植物表达载体的构建及在烟草中的表达

将TaNHX2基因重组于质粒pBIN438的CaMV 35S启动子下游,构建含TaNHX2基因的植物双元表达载体pBIN438-TaNHX2.采用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tobacum L.),获得含TaNHX2的转基因烟草植株.经PCR、RT-PCR分析表明,TaNHX2基因已整合到烟草中,并且得到表达.耐盐分析表明,外源基因TaNHX2提高了转基因植株的耐盐性.     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。