家蚕新的非编码RNA功能初探

构建了家蚕50～500 nt非编码RNA的cDNA文库,发现了189个新的ncRNA,其中一个小RNA-Bm-86在家蚕幼虫和蛹中的表达量显著高于卵和成虫.利用生物信息学软件对该ncRNA的特性及其与上下游基因的关系进行了深入分析,并利用Northern杂交和半定量RT-PCR技术对该ncRNA与其宿主基因在家蚕不同组织的表达情况进行了研究.结果发现,该ncRNA属于H/ACA box snoRNA家族,是由家蚕eIF5A基因的第二个内含子转录产生的,且在家蚕中没有明显的靶标位点.分析其上下游基因结构发现,在其上游263 bp处存在着一个可能的启动子位点,表明其有独立转录的倾向.进一步分析Bm-86与其宿主基因eIF5A在家蚕不同组织部位的表达情况发现,二者在表达上存在着负相关的关系,且该现象在丝腺中尤其明显.推测Bm-86可能通过影响eIF5A基因的表达参与到家蚕丝腺发育调控过程中.     

家蚕表皮型几丁质合成酶基因BmCHSA-2a的鉴定及其对激素的响应

文中采用5'Race方法获得了家蚕几丁质合成酶基因(BmCHSA-2a)的第1外显子(Exon 1,141 bp)和第2外显子(Exon 2a,106 bp),证明外显子2a在鳞翅目昆虫几丁质合成酶中高度保守.根据该外显子序列设计引物,分析BmCHSA-2a对激素的响应,结果表明:蜕皮激素(Ecdysone,20E)抑制BmCHSA-2a的表达;保幼激素(Juvenile Hormone,JH)间接促进其表达.根据家蚕基因组所预测的启动子序列,扩增了调控BmCHSA-2a表达的启动子,证明蜕皮激素抑制启动子活性,并存在大量蜕皮激素通路BmFTZ-F1的调控元件.对BmFTZ-F1表达调控的进一步研究表明:蜕皮激素抑制其表达.研究结果初步分析了家蚕表皮几丁质合成酶基因BmCHSA-2a可能的表达机制,为深入研究其表达调控机理及发现害虫防治新靶标提供了理论基础.     

家蚕表皮型几丁质合成酶基因BmCHSA-2a的鉴定及对激素响应

文中采用5'Race方法获得了几丁质合成酶基因（BmCHSA-2a）的第1外显子（Exon 1, 141 bp）和第2外显子（Exon 2a,106 bp）,证明外显子2a在鳞翅目昆虫几丁质合成酶中高度保守. 根据该外显子序列设计引物,分析BmCHSA-2a对激素响应分析. 结果表明蜕皮激素(Ecdysone ,20E)抑制BmCHSA-2a的表达,而保幼激素(Juvenile Hormone, JH)间接促进其表达. 根据家蚕基因组所预测的启动子序列,扩增了调控BmCHSA-2a表达的启动子,证明蜕皮激素抑制启动子活性,并存在大量蜕皮激素通路BmFTZ-F1的调控元件,对BmFTZ-F1表达调控的进一步研究表明,蜕皮激素抑制其表达. 研究结果初步分析了家蚕表皮几丁质合成酶BmCHSA-2a可能的表达机制,为深入研究其表达调控机理及发现害虫防治新靶标提供了理论基础.     

家蚕BmMet2基因的组织定位与激素诱导表达分析

Met作为保幼激素(JH)的受体, 能编码bHLH-PAS结构域结合DNA并调控下游基因的表达。为了探究BmMet2是否作为JH的受体参与调控家蚕的生长发育,以家蚕为材料,用生物信息学方法分析了BmMet2蛋白结构,利用实时定量PCR检测其在翅原基不同时期和激素诱导下的表达情况;原核表达了BmMet2中能与DNA结合的蛋白区域BmMet2DBD,并制备了抗体;利用蛋白质印迹法(Western blotting)和免疫组化检测了BmMet2在家蚕多个时期和各组织中的定位表达情况。结果显示:在翅原基中,BmMet2在5龄第3天和5龄第6天有较高水平的表达,蛹期的表达量较低,这与家蚕体内JH的滴度一致;BmMet2在5龄第6天、吐丝期和预蛹期的胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高的表达;JH和20E均对BmMet2有不同程度的诱导,说明其可能同时参与了JH和20E的调控, 进而参与调控家蚕变态发育过程。     

家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达

文章克隆得到家蚕(Bombyx mori)神经肽促咽侧体素受体基因(Allatotropin receptor,BommoATR),开放阅读框全长为1 254 bp,编码416个氨基酸.Bommo-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白,符合GPCR家族成员的典型特征.实时荧光定量PCR结果表明,家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高,其次为蛹后期,蛹前期和成虫阶段表达量最低.其中5龄幼虫第2天表达量最高,1～5 d持续维持较高的表达水平,这可能与保幼激素的合成有关.     

保幼激素和蜕皮激素对家蚕翅原基生长分化的影响

翅原基（Wing disc）是昆虫幼虫体内成虫原基的一种,经生长分化后最终形成成虫翅。翅原基是研究昆虫变态发育过程的一个理想系统。为探究发育过程中翅原基的生长变化,本文以家蚕翅原基为材料,通过离体和石蜡切片的方法观察了翅原基从5龄第3天至蛹期0天的形态变化,并通过注射外源蜕皮激素活性物质20E和保幼激素类似物Methoprene探究了昆虫激素对家蚕翅原基生长分化的影响。结果显示,翅原基在幼虫阶段发育缓慢,从5龄第6天起生长分化逐渐加快,且翅原基的形态发生了显著变化,原本附着于翅原基腔口处且呈团状的造血器官逐渐分散至消失,而由气管组成的翅脉逐渐形成。外源激素处理的结果显示,2μg剂量的20E可促进翅原基的生长分化,而2μg 的Methoprene抑制了翅原基的生长分化。上述结果暗示了,蜕皮激素和保幼激素共同调控了翅原基的生长分化,并最终实现了翅原基的变态发育。     

黄鳝性腺发育过程中Amh和SOX9基因的表达分析

文章研究了黄鳝性腺发育过程中抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh)基因和Sry相关高泳动类非组蛋白基因9(Sry-related high mobility group-box gene 9,SOX9)2个基因的表达量变化及关系,进而推断其基因表达通路,为研究黄鳝性逆转过程中基因的调控理论奠定基础。文章提取黄鳝Ⅰ龄卵巢(Ⅱ期卵巢)、Ⅲ龄卵巢、Ⅱ龄间期性腺早期、Ⅱ龄间期性腺后期、Ⅲ龄精巢5个时期的性腺组织RNA并反转录成cDNA,通过半定量和荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对其表达量进行定量分析。结果表明,Amh和SOX9基因在黄鳝性腺发育过程中的表达没有特异性,随着卵巢的败育和精巢的发育,表达量明显升高。Amh基因在Ⅲ龄精巢表达有显著增高,SOX9基因的表达量高于Amh(Ⅲ龄精巢例外)。Amh和SOX9基因的表达呈现正相关,后期Amh基因的表达量显著升高可能是由于存在一个诱导SOX9基因表达的信号,两者在黄鳝性逆转过程及精巢的发育过程中存在一定的协同关系,可能存在Amh—SOX9基因信号通路。     

赤点石斑鱼促性腺激素及其受体基因的克隆和表达模式分析

鱼类脑垂体分泌的促性腺激素(GtHs)与分布在性腺中的促性腺激素受体(GtHRs)所形成的信号通路,在性腺发育过程中发挥了重要作用.为了解GtH/GtHR信号通路在雌性先熟雌雄同体鱼类性腺发育过程中的作用,本文克隆了赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)GtHsβ亚基(FSHβ和LHβ)及其受体GtHRs(Fshr和Lhcgr)基因的序列,并分析了它们在性腺发育过程中的表达模式.结果表明:FSHβ和LHβ具有糖蛋白激素家族成员保守的结构特征;Fshr和Lhcgr具有糖蛋白激素受体亚家族保守的结构特征;FSHβ和LHβ基因仅在脑垂体表达,而Fshr和Lhcgr基因仅在性腺表达;在性逆转早期(ET)阶段FSHβ表达量处于低水平,但在性逆转后期(LT)阶段和雄性阶段表达量升高;LHβ的表达模式与FSHβ相似,但从ET阶段到LT阶段,与FSHβ相比其表达量的升高幅度较低;性腺中Fshr和Lhcgr在雌性和ET阶段表达量都很低,LT阶段明显上升,雄性阶段达到最高水平,但Fshr表达量远远高于Lhcgr.研究结果提示,GtH/GtHR通路参与了赤点石斑鱼的性腺发育过程,其中FSH信号通路在这过程中可能发挥更主要的作用.     

水稻（Oryza sativa L.）愈伤组织发育过程中Auxin-miR167-ARF8信号通路的研究

采用荧光定量PCR(Real-time PCR),进行miR167及其靶基因ARF8表达水平的相对定量分析,初步得出水稻愈伤组织发育过程中Auxin-miR167-ARF8信号通路的调控情况.发现经过12h～24h的积累,2mg/L的2,4-D能够明显地上调miR167的表达水平,从而导致miR167的靶基因ARF8的表达量下降,这种变化在第7天的时候趋于平缓,直到形成愈伤组织,miR167和ARF8的表达量维持在一个相对稳定的水平.本实验为Auxin-miR167-ARF8信号通路的研究提供了切入点.     

P因子介导mir-2基因簇原位过表达调节Yki的活性分析

Hippo信号通路在动物器官大小发育和肿瘤发生过程中发挥关键性作用.为了发掘新的Hippo信号通路活性调节因子,通过P因子插入介导基因原位过表达,在果蝇表型修饰筛选中鉴定了1株可以显著增强Hippo信号通路下游效应因子Yki活性的果蝇株MS004.反向PCR定位显示,MS004中P因子位于2号染色体左臂蛋白编码基因spitz的内含子区域;进一步的遗传分析确定,MS004果蝇株通过诱导位于spitz内含子区域的mir-2基因簇原位过表达增强Yki的活性.     

咪唑类化合物对天蚕幼虫生长发育的影响

本文报告了咪唑类化合物——金鹿三眠素对天蚕幼虫生长发育的影响。三龄0～48小时喂饲浸渍过500～2000ppm三眠素溶液的白栎鲜叶后,三眠蚕诱导率最高可达94.56％;诱导所得三眠蚕三、四龄历期明显延长,四龄起蚕体重和四龄末丝腺鲜重重于正常四眠蚕(对照),而三龄至结茧的总历期和熟蚕体重、丝腺鲜重则反之;仍为四眠蚕的三、五龄历期和三龄至结茧的总历期多长于对照、四龄起蚕和熟蚕体重大多重于对照。四龄0～48小时喂饲浸渍过500～2000ppm三眠素溶液白栎鲜叶后,极大多数仍为四眠蚕,三眠蚕诱导率最高仅为9.88％;其中四眠蚕四、五龄历期和四龄至结茧的总历期大多长于对照;诱导所得三眠蚕的四龄历期明显长于对照,但总历期反之。三眠蚕四龄期丝腺鲜重增长明显快于正常四眠蚕,但最终鲜重不及正常四眠蚕。     

斜纹夜蛾前胸腺的生长发育研究

 通过解剖观察4龄至蛹期斜纹夜蛾前胸腺,对其形态特点和生长发育规律进行了研究,主要结果如下：发现斜纹夜蛾前胸腺由53个左右的圆形或椭圆型细胞成串组成,Y型,成对,外围包裹一层透明鞘膜,位于胸部第一气门的气管丛内;在斜纹夜蛾4龄到蛹期的发育过程中,前胸腺不发生有丝分裂,细胞数量基本恒定;前胸腺细胞直径在幼虫发育期间不断增大,斜纹夜蛾幼虫在4龄第1天的前胸腺直径为(28.80±0.47) μm,而到了6龄末期,则增加到(92.22±2.43) μm;幼虫期的斜纹夜蛾前胸腺细胞直径和虫体体质量呈显著相关,r=0.826,P=0.000,拟合曲线方程为Y=82.1X ^0.263;此外,幼虫期的斜纹夜蛾前胸腺细胞直径和虫体体长也呈现出显著相关,r=0.886,P=0.000,拟合曲线方程： Y=e^{(4.781-1.863/Z)}。     

家蚕核膜部分消失现象的电镜观察与研究

应用电镜技术，对重要经济昆虫——家蚕后部丝腺细胞中核膜的超微结构在5龄期间的变化，进行了连续观察与研究。结果发现，家蚕后部丝腺细胞除具有典型的真核细胞核膜的精细结构外，还在5龄48h至144h反复出现核膜部分消失的奇特现象，并认为这一现象与核内外特别旺盛的生物合成作用密切相关。     

蟋蟀雄性生殖系统的结构和精子发生

研究了蟋蟀雄性生殖系统的结构和精子发生的动态过程 .成熟的雄性生殖系统主要由一对精巢 ,一对输精管 ,一对附腺 ,一对储精囊和一根射精管组成 .精巢乳白色由许多精巢管盘曲组成 ,精巢管包括原精区、生长区、成熟区和变形区四个区域 .其主要特点是处于不同发育时期的精母细胞呈放射状密集排列在圆球形的育精囊中 .精子发生的动态是 :一龄期 ,精巢小管仅具一些精原细胞 ;二～三龄期 ,精原细胞不断通过有丝分裂增殖 ;四龄期 ,初级精母细胞形成 ,并由减数分裂形成次级精母细胞 ;五龄期 ,精细胞大量形成 ,并变形成为精子 .其主要特点是成虫期的精巢管中存在所有各期生殖细胞 ,当下端的精子成熟时 ,上端部分的精母细胞再发育形成精子 ,表明从五龄开始蟋蟀便能连续不断地产生精子     

具保幼激素活性的昆虫生长调节剂对亚洲玉米螟Na+-K+-ATPase的影响初探

采用点滴法，室内研究了若干种具保幼激素活性的昆虫生长调节剂对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis末龄幼虫Na^ -K^ -ATPase的影响。结果表明，该影响随亚洲玉米螟幼虫的日龄变化和药剂结构的不同而有所不同，并推测Na^ -K^ -ATPase可能是具保幼激素活性昆虫生长调节剂的重要作用靶标之一。     

马尾松毛虫和荔蝽体内多酚氧化酶的初步研究

为了寻找不污染环境的“生物合理途径”新型杀虫剂，研究了马尾松毛虫和荔蝽体内的多酚氧化酶。发现马尾松毛虫幼虫的多酚氧化酶活力与虫龄大小成正相关。多来宝（ｅｔｏｆｅｎｐｒｏｘ）处理１００ｍｉｎ后，５龄幼虫的多酚氧化酶为正常虫体的３．６倍。荔蝽３龄若虫经乙醇处理１０ｍｉｎ后，多酚氧化酶活力为正常虫体的２．７倍；荔蝽３龄若虫经菟丝子（Ｃｕｓｃｕｔａｊａｐｏｎｉｃａ）和夹竹桃（Ｎｅｒｉｕｍｉｎｄｉｃｕｍ）的混合醇提液处理６０ｍｉｎ，多酚氧化酶活力为正常虫体的２．４倍、经乙醇单独处理荔蝽３龄若虫后多酚氧化酶活力为正常虫体的２．７倍。     

家蚕BmFKBP45基因的表达和功能分析

以家蚕（Bombyx mori）为研究对象,对果蝇DmFKBP39的同源蛋白BmFKBP45进行了表达和初步的功能分析. 对DmFKBP39和BmFKBP45进行氨基酸序列比对分析发现,它们都含有酸性氨基酸区域、碱性氨基酸区域、核定位信号及FKBP结构域. 将BmFKBP45的第2个碱性区域与核蛋白HMG2的DNA结合位点进行比对,相似性达到21%,推测BmFKBP45可通过其第2个碱性区域与DNA结合,但EMSA的结果显示重组BmFKBP45不与果蝇的JHRE1元件结合. RT-PCR和Western blot结果显示,BmFKBP45在各个发育时期的家蚕翅原基中都有表达,在蛹期的表达量逐渐下降. 激素处理实验结果显示,BmFKBP45的表达并不受20E和JH的影响. 利用Pull-down、Far-western blot和Co-IP实验鉴定出一个与BmFKBP45相互作用的蛋白Bm6G1. 这些研究结果为进一步探究BmFKBP45的功能提供了线索.