原生殖细胞的体外培养及发育潜能

原生殖细胞(PCCs)是配子的始祖细胞,它发育演变生成卵细胞或精于细胞,上世纪90年代发展了体外培养PGCs技术,现在PCCs已能通过体外培养形成多潜能干细胞系(EG细胞系),对于研究体外分化机制和细胞治疗具有重要意义,本文综述了原生殖细胞的体外培养和EG细胞系的建立以及原生殖细胞的发育潜能,并展望了原生殖细胞研究领域未来的发展。     

保护剂浓度对第19期鸡胚原始生殖细胞存活率的影响

采用Ficoll密度梯度离心 ,提取第 19期 (孵化 72h)性腺中的原始生殖细胞 (PGCs) ,用不同浓度的冷冻保护液进行冷冻保存。复苏后的PGCs用台盼蓝染色检测其存活率 ,并进行体外培养。结果发现 :在同一浓度下 ,不同的冷冻保护液之间存在显著 (P <0 0 5 )或极显著 (P <0 0 1)差异。在同一种冷冻保护液下 ,不同的浓度之间存在显著(P <0 0 5 )或极显著 (P <0 0 1)差异 ,具体表现为冷冻保护液浓度越大 ,复苏后细胞的存活率越低。PGCs复苏后于体外培养 ,可增殖形成细胞克隆 ,并可传代培养     

原生殖细胞的迁移、增殖及其与细胞因子的关系

原生殖细胞(PGCs)是配子的始祖细胞,它发育演变生成卵细胞或精子细胞．PGCs在其发育过程中不断地增殖并迁移,最终到达生殖嵴．本文综述了原生殖细胞的发生,迁移及其机制,原生殖细胞与细胞因子,如干细胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和骨形态发生蛋白(BMPs)等的关系．     

小鼠精原干细胞的分离、分选、移植和培养

精原干细胞具有自我增殖和分化为精子的能力。精原干细胞的培养、移植和体外诱导分化等研究将使我们最终阐明精原干细胞的自我更新机制和精子发生机理。经过一年多的研究,我们不仅建立了用含血清培养基对分离的乳鼠睾丸细胞进行差异贴壁分选来富集生殖细胞的简单方法,而且成功地对分选出的精原干细胞进行了近一个月的无血清培养。流式分析结果表明,差异贴壁分选能将精原干细胞富集11倍以上。移植分析表明,分选出的精原干细胞具有在受体鼠的曲精小管中产生克隆的能力和正常生精作用。免疫细胞化学和RT-PCR检测表明,培养的细胞表达精原干细胞标志基因。该研究为体外长期培养小鼠或其它哺乳动物的精原干细胞提供了一个范例,也为利用基因修饰的精原干细胞通过移植产生转基因动物奠定了基础。     

利用四倍体胚胎补偿法克隆ES猪技术

胚胎干细胞（ES）是从附植前胚胎内细胞团（ICM）或胎儿原始生殖细胞（PGCS）分离而来的经过体外长期培养、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的全能性或多能性细胞,通常我们又把从原始生殖细胞分离而来的胚胎干细胞称谓胚胎生殖细胞（EG）。由于胚胎干细胞具有特殊生物学特性,     

黑脊倒刺鱼巴原生殖细胞起源和迁移的研究

在显微及亚显微的水平上,对黑脊倒刺鱼巴原生殖细胞(PGCs)的起源和迁移的过程进行了研究.PGCs最早发现于低囊胚期的囊胚层,后来从早期胚胎的下胚层迁移到脏壁中胚层,再沿着肠系膜迁移到两侧的生殖嵴中,最终与生殖嵴细胞共同组成未分化的性腺.其迁移过程既与周围组织细胞的推动有关,也与其自身的主动迁移能力有关.     

精原干细胞体外培养的方法改进

探讨精原干细胞体外培养优化方法,为进一步探讨其生物特征、生殖干细胞移植及生殖损伤及药物保护等研究提供实验基础.制备骨髓基质饲养层,将生后5 d~7 d雄性小鼠生精细胞接种在饲养层上,并于IMDM培养基及37 ℃下共培养,在倒置显微镜下观察细胞生长行为,并对培养后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化、遗传学鉴定.精原干细胞能在以骨髓基质细胞饲养层上进行增殖和生长,且增殖后的表现出呈簇、团状生长,细胞间可表现出明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条)等精原干细胞的生物学行为特征.原代培养的骨髓基质细胞作饲养层具有取材及制作简便等优点,且能在不添加外源性生长因子的前提下能通过自分泌足够的细胞生长因子,满足精原干细胞体外增殖和抑制分化的需要,是精原干细胞培养的一种良好的饲养层.IMDM培养基、血清及适宜的环境温度是精原干细胞体外培养的重要条件.     

原癌基因c-raf在精原干细胞中的表达及作用

本研究用基因测序和BLAST检验扩增的精原干细胞DNA和c-raf的同源性;用MTT法观察c-rafASODNs(反义c-raf寡脱氧核甘酸)拮抗c-raf对体外培养精原干细胞培养的作用,探讨原癌基因c-raf对体外精原干细胞培养增殖的影响.实验结果显示扩增的精原干细胞DNA和c-raf的同源性98%;c-rafASODNs对体外培养的精原干细胞存活呈剂量依赖性抑制作用(P<0.05).提示c-raf在精原干细胞中表达;原癌基因c-raf促进精原干细胞体外培养的增殖.     

小鼠胚胎干细胞系的建立及向雌性生殖细胞诱导的研究

胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能的两大特性.在体外产生功能性的配子需要模拟体内生殖细胞发育的多个步骤.而将胚胎干细胞诱导成生殖细胞对于生殖细胞特化的机制研究以及在辅助生殖领域的应用都有着重大的意义.建立了具有生殖系转移能力的雌性胚胎干细胞系,并在体外将其定向分化成原始生殖细胞样细胞,这些原始生殖细胞样细胞在体内可以发生减数分裂,证明了诱导的生殖细胞具有功能性.建立一个有效的生殖细胞诱导的平台,为以后研究体外配子的发生打下了坚实的基础.     

半滑舌鳎早期胚胎性腺原基分化的组织学

采用连续组织切片对半滑舌鳎胚胎及仔鱼进行了观察研究,首次描述了半滑舌鳎胚胎发育过程中原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)出现的部位及迁移特征,以及卵黄合胞体,鳔与性腺原基的发育分化.结果发现,PGCs出现于神经胚期的靠近卵黄囊的囊胚层.PGCs的特征为体积比周围细胞大,核大透亮,随后在肌肉期的脊索壁上出现.孵化前期的PGCs迁移到肠原基附近,肠系膜旁可见尚在移动的PGCs和10日龄的仔鱼中在肾管旁出现性腺原基,以后PGCs数量逐渐增多参与性腺的形成.本研究为半滑舌鳎的发育生物学以及养殖生产实践提供参考.     

Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture.

Primordial germ cells (PGCs) are first identifiable as a population of about eight alkaline phosphatase-positive cells in the 7.0 days postcoitum mouse embryo. During the next 6 days of development they proliferate to give rise to the 25,000 cells that will establish the meiotic population. Steel factor is required for PGC survival both in vivo and in vitro and together with leukaemia inhibitory factor stimulates PGC proliferation in vitro. In feeder-dependent culture, PGCs will proliferate for up to 7 days, but their numbers eventually decline and their proliferative capacity is only a fraction of that seen in vivo. Here we report a further factor that stimulates PGC proliferation in vitro, basic fibroblast growth factor (bFGF). Furthermore, bFGF, in the presence of steel factor and leukaemia inhibitory factor, stimulates long-term proliferation of PGCs, leading to the derivation of large colonies of cells. These embryonic germ cells resemble embryonic stem cells, pluripotent cells derived from preimplantation embryos, or feeder-dependent embryonal carcinoma cells, pluripotent stem cells of PGC-derived tumours (teratomas and teratocarcinomas). To our knowledge, these results provide the first system for long-term culture of PGCs.     

Germline transmission of genetically modified primordial germ cells

Primordial germ cells (PGCs) are the precursors of sperm and eggs. In most animals, segregation of the germ line from the somatic lineages is one of the earliest events in development; in avian embryos, PGCs are first identified in an extra-embryonic region, the germinal crescent, after approximately 18 h of incubation. After 50-55 h of development, PGCs migrate to the gonad and subsequently produce functional sperm and oocytes. So far, cultures of PGCs that remain restricted to the germ line have not been reported in any species. Here we show that chicken PGCs can be isolated, cultured and genetically modified while maintaining their commitment to the germ line. Furthermore, we show that chicken PGCs can be induced in vitro to differentiate into embryonic germ cells that contribute to somatic tissues. Retention of the commitment of PGCs to the germ line after extended periods in culture and after genetic modification combined with their capacity to acquire somatic competence in vitro provides a new model for developmental biology. The utility of the model is enhanced by the accessibility of the avian embryo, which facilitates access to the earliest stages of development and supplies a facile route for the reintroduction of PGCs into the embryonic vasculature. In addition, these attributes create new opportunities to manipulate the genome of chickens for agricultural and pharmaceutical applications.     

Effect of Steel factor and leukaemia inhibitory factor on murine primordial germ cells in culture.

Despite the importance of germ cells to the survival of species, surprisingly little is known about their embryological origin, proliferation, migration and entry into mitotic arrest or meiosis. Mutations in the murine Dominant White Spotting (W) and Steel genes, which respectively encode the c-kit tyrosine kinase receptor and the c-kit ligand (or Steel factor), impair the development of primordial germ cells (PGCs) in vivo, as well as haematopoietic stem cells and neural crest-derived melanoblasts. Here we use a monoclonal antibody against c-kit tyrosine kinase receptor and recombinant Steel factor to study the c-kit receptor-ligand system in cultured PGCs. In addition, we show that leukaemia inhibitory factor (also known as differentiation inhibitory activity), a factor secreted by STO fibroblasts, can stimulate proliferation of primordial germ cells in vitro.     

大脑皮质微血管内皮细胞培养及其缺氧性损害模型

建立改良的体外培养大鼠脑皮质微血管内皮细胞缺氧模型．取1～5d Wistar乳鼠脑皮质获得的脑微血管内皮细胞（BMEC）进行体外培养，缺氧组置入一个经改造的保鲜盒内，密闭并通入混合气体（95％N2和5％CO2）12h，检测缺氧细胞的形态结构、细胞死亡率及培养液中乳酸脱氢酶漏出量．结果显示缺氧BMEC形态结构损伤，细胞死亡率增加，细胞乳酸脱氢酶漏出量显著增加（p〈0．01）．该模型可使脑血管内皮细胞受到损伤，证实该模型具有一定的可靠性、操作简便，可重复性强，为体外研究脑血管疾病提供帮助．     

Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad

The ability of organs such as the liver or the lymphoid system to maintain their original size or regain it after injury is well documented. However, little is known about how these organs sense that equilibrium is breached, and how they cease changing when homeostasis is reached. Similarly, it remains unclear how, during normal development, different cell types within an organ coordinate their growth. Here we show that during gonad development in the fruitfly Drosophila melanogaster the proliferation of primordial germ cells (PGCs) and survival of the somatic intermingled cells (ICs) that contact them are coordinated by means of a feedback mechanism composed of a positive signal and a negative signal. PGCs express the EGF receptor (EGFR) ligand Spitz, which is required for IC survival. In turn, ICs inhibit PGC proliferation. Thus, homeostasis and coordination of growth between soma and germ line in the larval ovary is achieved by using a sensor of PGC numbers (EGFR-mediated survival of ICs) coupled to a correction mechanism inhibiting PGC proliferation. This feedback loop ensures that sufficient numbers of PGCs exist to fill all the stem-cell niches that form at the end of larval development. We propose that similar feedback mechanisms might be generally used for coordinated growth, regeneration and homeostasis.     

皮蛋模拟胃肠道消化物对HepG2细胞的影响

皮蛋是中国传统食品,其水解物具有抗氧化、抗炎和抗癌等功效,具有良好的医学前景,但目前皮蛋发挥抗癌功效的途径及作用机制尚不清楚。探究了皮蛋模拟胃肠道消化物(preserved eggs simulated gastrointestinal digests,PESD)对人肝癌HepG2细胞增殖和细胞周期的影响。将皮蛋经体外模拟胃肠道消化处理后,进行细胞实验,用CCK-8法进行细胞增殖分析,研究PESD对HepG2细胞存活率的影响,采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色标记的方法,通过流式细胞术测定PESD对HepG2细胞周期的影响,用western blot法测定细胞周期相关调控蛋白的表达。研究发现:PESD以剂量依赖性方式对HepG2细胞增殖进行抑制,IC₅₀为4.17mg/mL;PESD处理显著增加了S期细胞的占比(P<0.05),使HepG2细胞阻滞于S期;4mg/mL的PESD处理HepG2细胞24h后,细胞中cyclin A、cyclin E、ATM、chk2和CDC25A的蛋白表达水平上升(P<0.05),而CDK2蛋白表达水平下降(P<0.05)。研究认为,皮蛋模拟胃肠道消化物是以剂量依赖性的方式来抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,主要是通过ATM-chk2-CDC25A信号通路,上调cyclin A和cyclin E蛋白的表达,下调CDK2蛋白的表达来实现人肝癌HepG2细胞阻滞于S期,影响人肝癌HepG2细胞周期进程,抑制癌细胞的增殖。研究结果旨在为皮蛋抗癌作用机制的阐明提供一定的理论基础。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞rMSCs的方法,检测传代细胞的细胞周期,并分析部分细胞表型,对rMSCs进行初步的鉴定。方法:密度梯度离心结合贴壁培养法分离培养rMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原,流式细胞仪检测细胞周期。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样,细胞周期显示90.16%P1代细胞处于G0/G1期,免疫组化结果为:CD44、CD29阳性、CD34阴性,说明培养的细胞即非造血干细胞,也非成纤维细胞。结论:本实验分离培养的细胞群与间充质干细胞的生物学特性吻合,说明密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞稳定表达CD44、CD29,是实用、可行的方法,所培养的细胞可用于细胞移植等研究。     

鸟类原生殖细胞的实验观察

本文系统地报导了鸟类原生殖细胞(PGC_s)的实验观察。初步提出了关于使用简易方法制备鸟类PGC_s标本的一系列技术(包括取胚、取胚血、制作胚血涂片、活胚标本、整胚装片和胚组织切片等)。实验观察表明,鸟类PGC_s可以在光镜下借助普通细胞学和组织化学相结合的方法进行鉴别。     

丁香毒杀赤拟谷盗卵的胚胎学研究

赤拟谷盗是世界性仓库害虫。本研究采用环境扫描电镜研究了不同胚胎发育期卵的表面结构及胚胎发育过程,特别是研究了丁香及其化学成分对赤拟谷盗卵的毒杀作用。研究表明赤拟谷盗卵呈椭圆形,表面光滑;发育60 h时,卵的一端已经明显出现分化;发育76 h时,已经可以见到头部发育完整的幼虫;至92 h时,卵已经开始孵化。丁香处理的赤拟谷盗卵,部分卵能发育为幼虫,但幼虫均不能正常孵化而死亡。其中,发育12 h后用丁香处理的赤拟谷盗卵不能发育为幼虫而干瘪死亡,发育36 h后用丁香处理的卵虽能部分发育为幼虫,但幼虫全部在卵壳内死亡,发育84 h后用丁香处理的卵,部分幼虫在孵化时死亡。目前主要用化学防护剂和熏蒸剂防治储藏害虫,用植物源的丁香控制赤拟谷盗具有较大的应用价值。