纯化组氨酸标签蛋白金属螯合亲和色谱填料的制备与性能

以琼脂糖（agarose）凝胶的珠状产品SepharoseC1—6B为基质，以环氧氯丙烷为活化剂，将天冬氨酸固定在琼脂糖凝胶微球上，在经与溴乙酸修饰后，最终得到含有羧甲基天冬氨酸结构的琼脂糖凝胶微球，以凝胶微球负载的多羧基为配体分别与Co^2＋及Ni^2＋配位分别得到两种金属螯合亲和层析介质．依照上述方法制备了具有不同负载羧基含量的色谱介质，以六聚组氨酸融合蛋白为分离样品，研究了所制备的色谱分离介质的分离纯化性能，并与商品化色谱分离介质Agarose—NTANi进行了比较．结果表明，目标介质蛋白结合容量大，与蛋白结合快、易洗脱、选择性高，金属离子不易脱落。     

镍化磁性琼脂糖凝胶微球的制备及其在蛋白纯化中的应用研究

以自制磁性琼脂糖微球为基质,环氧氯丙烷为活化剂,亚氨基乙二酸作为螯合剂,制备了表面螯合Ni2＋的磁性凝胶微球（Mag—Agarose—Ni）．IR结果表明Ni2＋成功螯合到了磁性凝琼脂糖胶微球上;SEM结果显示在螯合Ni2＋后,Mag—Agarose-Ni形貌没有发生明显变化,且平均粒径为23btm;原子吸收光谱结果表明Mag—Agarose-Ni表面螫合的Ni2＋的量为2．12×10mol／mg;磁性能测试表明Mag—Agarose-Ni具有超顺磁性,其磁饱和强度为20．8emu／g,具有良好的磁响应性．将Mag—AgaroseNi用于六聚组氨酸融合蛋白K8的纯化研究,SDS-PAGE结果表明Mag—Agarose—Ni较市售Ni—NTA对K8具有更优的亲和分离效果,经15min的孵育后,Mag—Agarose—Ni对K8的吸附容量可达到8．8μg／mg．     

固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白

目的 研究利用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的洗脱方法 ,以优化分离纯化的条件.方法 将吸附了重组类人胶原蛋白的层析柱采用降低pH,增大离子强度和增大NH4Cl浓度3种方法 进行洗脱.结果 采用增大NH4Cl浓度的方法 进行洗脱所得的洗脱峰面积最大,洗脱体积最小,纯化后重组类人胶原蛋白的纯度达97.9%,回收率为68.6%,纯化倍数为2.78.结论 采用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白是可行的,可有效地对重组类人胶原蛋白进行纯化.     

以自制铜螯合亲和层析柱纯化牛血铜、锌超氧化物歧化酶

本文以自制铜螯合亲和层析柱对牛血铜锌超氧化物歧化酶进行纯化。酶比活提高１１倍，回收率为６１．５％，简便、快速，层析结果重复性好。     

基因重组融合蛋白的纯化

本文论述了基因重组融合蛋白纯化过程和存在的问题.     

用金属螯合柱一步纯化和复性重组人血管生长抑制因子(rhB)

rhB基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 .利用其产物N端携带 6个连接的组氨酸与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性 ,应用Ni -NTA金属螯合层析在蛋白质变性条件下进行纯化 ,并对纯化样品的复性进行了研究 ,分析和比较了不同复性方法和复性条件对其复性率的影响 .实验结果表明 ,在变性条件下经纯化的样品在Ni柱上不经洗脱 ,用 8.0mol/L～ 1.0mol/L尿素梯度洗涤可使样品在柱上直接复性 .用该法除了可有效地提高复性率外 ,还可使整个纯化过程变得简单、快速和高效 .一步层析即可得到高纯度的且具有生物活性的rhB .     

重组基质金属蛋白酶MT5-MMP的表达、 纯化和复性

对已经构建成功并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的基质金属蛋白酶MT5 MMP的催化结构域进行诱导表达, 得到分子量为21000, 包涵体形式的重组蛋白. 通过离子交换树脂对目的蛋白进行纯化后, 用凝胶过滤树脂对纯化后的蛋白进行柱上复性, 得到了具有较高活性的重组蛋白.     

重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白的分离纯化

考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明：包涵体经7mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT变性;1mol/L尿素,2mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G50 柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68mg/g干菌体。     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

GST融合蛋白包涵体纯化方法的探索

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

固定化金属离子亲和色谱研究进展

 固定化金属离子亲和色谱是将过渡金属离子通过配体螯合在固相基质上,通过过渡金属离子与靶分子的组氨酸或半胱氨酸特异性结合形成相对稳定的复合物,最后以竞争性洗脱方式实现靶分子的富集与纯化,其核心为金属螯合亲和基质材料制备。具有亲和选择性高、生物兼容性好、可逆再生等优势,迄今已发展了40余年,广泛应用于靶分子的特异性富集、分离与纯化,本文综述了近3年固定化金属离子亲和色谱纳米材料、微球色谱基质、棉纤维、分子印迹材料、整体材料、共价有机骨架等方面的研究进展。     

单克隆抗体亲和层析纯化基因工程人γ-干扰素研究

用抗基因工程人γ－干扰素单克隆抗体（２Ａ１２）细胞株亲和层析从表达人γ－干扰素的大肠杆菌抽提液中纯化经稀释复性后的γ－干扰素。一步纯化后的γ－干扰素含量达９５％以上，蛋白质的比活性达 １．２×１０ｕ／ｇ，收率为７８％。洗脱液用 ０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣＩ的 ＰＢＳ溶液，洗脱率达９２．８％。     

径向整体柱制备蛋清蛋白

以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂,制备含高活性基团的整体材料基质。以亚氨基二乙酸为配体,通过螯合铜离子,形成固定化铜离子的径向整体柱。通过分离蛋清蛋白,该整体柱不仅对蛋清蛋白具有高速高效的分离能力,而且柱容量大、回收率高、重现性好。     

植物血球凝集素-Sepharose 4B亲和层析纯化人绒毛膜促性腺激素

本文报道一种新的制备和纯化HCG的方法．人工流产物经45％乙醇抽提、调pH5．2～5．4后40～60％乙醇分级、植物血球凝集素-Sepharose4B柱层析纯化后,低温酒精沉淀干燥,可得到比效价3777.8IU／mg的hCG精品．     

3,4-(二丁基锡)二氧基苯甲醛与苯胺希夫碱的合成及表征

３，４－二羟基苯甲醛与二丁基氧化锡反应制备了新化合物３，４－（二丁基锡）二氧基苯甲醛，后者与芳伯胺缩合，合成了４种未见文献报道的希夫碱，通过元素分析、ＩＲ以及１ＨＮＭＲ进行了表征     

重组产几丁质酶C工程菌包涵体的复性

将重组产几丁质酶C(Chi C)的菌体通过固定金属鳌合层析(IMAC),对目的蛋白进行初步纯化;然后采用透析法、凝胶过滤柱层析法和金属鳌合柱层析法对包涵体进行复性.结果表明,逐渐降低变性剂尿素浓度进行透析复性,酶液的酶活力为58.85 μkat·L-1,比活为0.425 mkat·g-1,蛋白回收率为95.3%.使用S...     

系膜细胞膜固相色谱法研究丹皮中的效应成分

丹皮常被用于治疗肾病的中药复方中,但其活性成分并不明确,因此,采用肾小球系膜细胞膜固相色谱法分析丹皮中的效应成分.培养小鼠肾小球系膜细胞,并作为固定相选择性结合丹皮中的活性成分,排除未与细胞膜靶点结合的非活性成分后,使细胞膜靶点失活,解离系膜细胞膜上被结合的活性成分,用UPLC对解离液进行分析.结果表明丹皮酚是丹皮与肾系膜细胞结合的成分,因此认为丹皮酚是丹皮中的效应成分.