水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA_2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf( )的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。结果表明,中国分离物与日本分离物的REPI片段具极高的序列同源性。将REPI片段克隆到原核高效表达载体pJW2的P_RP_L启动子下游,经温度诱导,获得了高效     

水稻条纹叶枯病毒分子生物学的研究——外壳蛋白分子量、氨基酸组成和N末端

水稻条纹叶枯病是水稻的主要病害之一,其病原为水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus,RSV)。RSV通过灰稻虱(Laodephax striatellus)等三种介体传毒,能侵染水稻、小麦、玉米等37种禾本科植物,引起严重减产。Koganezawa首次报道了RSV具有分枝线状结构,Toriyama提出RSV是三组分病毒,含有一种分子量为32000的外壳蛋白(CP)及4种单链RNA,最近他又在RSV颗粒中发现了相应的4种双链RNA。在我国水稻条纹叶枯病亦广     

SARS相关病毒(BJ01株)的全序列及其比较分析

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新发现的急性传染病. 对一株已确认为SARS病原体的冠状病毒(BJ01)进行了全基因组序列测定, 并与其他已知病毒进行了比较分析. 该病毒基因组全长为29.725 kb, 含11个可读框(ORFs), 由1个稳定区和1个可变区组成, 其中稳定区编码RNA依赖性RNA聚合酶, 包括两个ORFs；可变区含有4个蛋白质编码序列(CDSs), 分别编码病毒的4个结构蛋白(S, E, M, N蛋白). 此外, 可变区还包括5个非典型的预测蛋白(PUPs). 此病毒基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致. 通过与已知RNA病毒的序列比对, 可以确认该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae). 与GenBank中已知的5个SARS相关病毒全基因组序列的比较分析显示, 已在30个核苷酸位置上检出序列差异, 总体突变率为0.1%, 其中15个变异位点在编码区, 可能会导致蛋白质的氨基酸改变(异义突变). S蛋白中已发现3处可能引起该蛋白质物化特征变化的变异, 而该蛋白质可能参与病毒与宿主间的免疫反应. 与病毒包膜形成相关的M蛋白中则已发现两处氨基酸变化. 进化分析表明, SARS病毒可能不是来源于人类, 但没有证据证明是人为制造的. 为了阐明SARS相关病毒的病因学以及排除其他可能的SARS病原体的存在, 仍需进行更深入的研究.     

“垃圾”DNA的奥秘

依据DNA双螺旋和遗传信息的中心法则,只有编码蛋白的DNA才被认为是有功能的.然而人类基因组大小与蛋白质数量矛盾以及生物体进化与基因组大小的不相关性(即C值悖论),导致科学家对非编码DNA概念的提出,戏称这些DNA为"垃圾"DNA.随着第二代测序技术发展以及数据分析能力的提升,大量研究表明,这些"垃圾"DNA很多都可以在生理与疾病状态下特异性转录.同时,疾病全基因组相关联研究显示,大量与疾病相关单核苷酸多态性位点位于非编码区,这共同证明了它们是有功能的.进一步研究表明,人类基因组中至少75%的序列是转录的,并将这些转录且不编码蛋白质的产物称为非编码RNA.本研究组系统总结了3大类非编码RNA包括微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA的定义和分类以及在疾病中的功能,对这些的非编码RNA的研究将会为疾病的治疗以及诊断方法开启新纪元.     

猪瘟病毒石门株全基因组cDNA文库构建、序列测定及分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了 1 8对覆盖全长基因组的引物 .应用RT PCR技术从猪瘟病毒石门株感染的猪血中扩增出各相应的cDNA片段 ,分别克隆 ,构建了石门株全基因组的cDNA文库并完成了序列测定 .石门株基因组全长 1 2 2 98nt,其中 5′端和 3′端非编码区长度分别为 373和 2 31nt,中间一个大的开放阅读框长 1 1 6 97nt,翻译成一个包含3898个氨基酸残基的多聚蛋白 .还对石门株序列与其他猪瘟病毒序列进行了分析比较     

猪瘟病毒基因组非编码区的定性、定量与结构分析

猪瘟病毒是猪瘟的病原体,弄清其基因组的复制与表达是研究猪瘟致病机理、研制抗病毒药物的核心,基因组的非编码区（UTR）是复制和表达的主要调节区,为了确定复制与表达位点在非编码区的具体位置以及主要特征,对猪瘟病毒石门株以及其他毒株基因组的3′和5′非编码区进行了生物信息学的定性、定量与结构分析,分别得到17个毒株的3′UTR和56个毒株的5′UTR与调节复制、表达起始有关的位点以及共有的保守序列和结构成分,这些顺式调控元件可能是复制起始识别位点、宿主细胞转录因子的结合位点和核糖体起始蛋白质合成的作用位点,据此,对猪瘟病毒复制与表达的机理进行了探讨,为进一步实验提供了非常明确的方向,同时也为与猪瘟病毒同科的丙型肝炎病毒、其他瘟病毒以及其他正链RNA病毒基因组复制的研究奠定了基础。     

果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

两种植物病毒编码蛋白的基因沉默抑制子功能鉴定

采用农杆菌浸润方法以及重组的马铃薯X病毒(PVX)表达载体, 研究了甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)编码的P14蛋白和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的S6蛋白对植物基因沉默的抑制作用. 绿色荧光蛋白(GFP)表型观察及核酸杂交结果表明, 这2种病毒基因均能够强烈抑制转基因本生烟(16C)中由同源序列引起的gfp基因沉默, gfp基因mRNA的含量明显高于未发生沉默抑制的对照植株, 并导致PVX感染后的寄主症状加重, 说明它们可能是由病毒编码的RNA沉默抑制因子. 其中, RBSDV S6基因对植株体内基因组DNA甲基化过程的抑制作用更为强烈.     

单核苷酸多态性的作用

细胞基因组是由编码区和非编码区构成的,编码区也叫外显子,非编码区也叫内含子。把出现在编码区和非编码区内的小的遗传变异,统称为单核苷酸多态性(SNPs)。SNPs的结果是遗传密码的简并,由多个核苷酸碱基的三联体(密码子)代表一种氨基酸。这些密码子是同义的,由于许多SNPs只是导     

真核生物重复DNA顺序的研究进展

与原核生物相比,真核生物一般包含更大的基因组,其中不仅包含原核生物中已存在的单拷贝DNA顺序,还包含相当大部分的重复顺序。每个单倍人体基因组含3.2×10~9bp,其中仅有2～3％为编码基因,而绝大部分为非编码基因。非编码基因包括基因间隔顺序及各种重复顺序。这类重复顺序以几种方式存,根据它们的结构、分布及重复频率等特性可以对这些顺序分类。从重复频率上来分,可将重复顺序分为高度重复顺序和中度重复顺序,前者的值一般在10~(-4)～10~(-1)之间,重复频率大于10~5,每个重复单位大约长10～300核苷酸对;而后者值一般在10~(-1)～10~(-2)之间,重复频率在10~2～10~5之间。它们在基因组中有散在分布的,也有串联排列的。     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

成熟登革病毒颗粒在中性培养条件下的冷冻电子显微镜三维重构

登革病毒(Dengue virus, DEN)为单股、正链RNA病毒, 属黄病毒科黄病毒属, 是依靠蚊子传播的虫媒病毒. 其基因组长约10.8 kb, 只有1个可读框, 编码3个结构蛋白(衣壳蛋白(C)、前膜蛋白(prM)和包膜蛋白(E))和7个非结构蛋白. 在内质网内膜组装DEN非成熟颗粒, 径长约60 nm, 囊膜由60个prM-E异二聚体形成的三聚体构成[1]. 在经过高尔基体的输运过程中, prM蛋白被剪切酶(furin)酶切为M蛋白, 包膜蛋白及其排列发生构象变化, 由90个E蛋白二聚体呈木排状平行于病毒表面紧密排列, 形成颗粒径长约50 nm的成熟颗粒[2]. ...........     

从烟草上分离的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNA的全基因组结构特征

从我国云南省红河地区表现曲叶症状的烟草上分离到病毒分离物Y8, Y36和Y38. 用14种针对双生病毒粒子的单克隆抗体进行三抗体夹心ELISA测定, 结果表明, 病毒分离物Y8, Y36和Y38的抗原表位型与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)相似. 对Y8, Y36和Y38基因组DNA-A全序列进行了分析, 其全长分别为2727, 2730和2730个核苷酸, 均编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV₁(CP)和AV₂两个ORFs, 互补链编码AC₁~AC₄四个ORFs. DNA-A全序列、基因间隔区核苷酸序列及各ORF编码的氨基酸序列比较分析表明, Y8, Y36和Y38均属于TYLCCNV. 从病株Y8, Y36和Y38中还分离到一类卫星DNA分子(DNAb), 全长分别为1338, 1339和1338个核苷酸. 3个DNAb分子的核苷酸全序列的同源性为98%~99%, 且互补链上均含有编码126个氨基酸的C1 ORF.     

寨卡病毒非结构蛋白NS5的结构与功能研究进展

寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)是黄病毒科黄病毒属重要成员,因其能引起小头症、格林-巴利综合征等严重神经疾病引起了全球的关注. NS5蛋白是其基因组编码的最大非结构蛋白,主要包括N端的甲基转移酶MTase(methyltransferase)结构域和C端的RNA依赖的RNA聚合酶RdRp(RNA-dependent RNA polymerase)结构域. NS5蛋白是一个多功能蛋白,不仅负责病毒基因组的复制和加帽过程,而且参与调控宿主的多种天然免疫反应.鉴于其具备重要的生物学功能, NS5蛋白被广泛认为是抗病毒药物设计的重要靶标.近年来,寨卡病毒NS5蛋白的高分辨率结构被成功解析,其生物学功能的研究也取得了重要突破,本文就相关领域的最新进展作一简要综述.     

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统, 根据已测定的DEN2-43全基因组序列, 利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子, 并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆. 将此克隆体外转录后, 经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒. 结果表明, 获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性, 所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力, 且可稳定传代. 该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.     

麂属rDNA限制性位点多态性及其系统进化

核糖体RNA基因家族(rRNA gene或rDNA)是一类中等重复的DNA序列,每个重复单元由非转录间隔区(nontranscribed spacer,NTS)、转录间隔区(internal transcri-bed spacer,ITS)和三种rRNA(18S RNA,5.8S RNA,28S RNA)基因编码区组成.由于rDNA遵循协同进化(concerted evolution)模式,种内个体间重复单元的序列差异不     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4的菌传功能分析

构建了甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）RNA4全长核苷酸序列以及5种编码区突变体的侵染性cDNA克隆，不同结构伯RNA4体外转录物与只含有RNA1，2和3的BNYVV分离物总RNAs混合后分别接种寄主植物番杏（Tetragonia expansa）作为毒源，繁殖后接种甜菜，利用无毒甜菜多黏菌(Polymyxa betae）进行传毒实验，结果表明，RNA4编码区内各种缺失突变均能显著地抑制多黏菌的传播，但插入4个碱基的移码突变体对传毒没有影响，说明BNYVVRNA4中的部分核苷酸序列对于被真菌介体高效传播是必需的，并且可能是在RNA水平上具有功能。     

发现新型非编码RNA

据英国Nature Structural&Molecular Biology,2015,doi:10.1038/nsmb.2959报道,中国科学技术大学单革实验室的李兆勇等人发现一类新的非编码环状RNA,在细胞核内调节亲本基因的转录。非编码RNA是指细胞内不编码蛋白质却行使多种生物学功能的RNA,而环状RNA大多为非编码RNA。李兆勇等人通过交联和免疫沉淀方法找到111种与RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)有关的环状RNA,并对其中两种circEIF3J和circPAIP2进行了详细研     

研究发现长非编码RNA调控RNA聚合酶Ⅰ的转录功能

正长度大于200个核苷酸的长非编码RNA,曾被认为是基因组转录的"暗物质"。然而,近年来的大量研究表明,长非编码RNA参与一系列细胞重要功能调控,如细胞核亚结构的形成、基因表达调控、表观遗传调控等。2017年5月5日的《细胞》杂志报道了长非编码RNA一种全新的功能:调控RNA聚合酶I的转录活性。