无血清微载体培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的条件优化

 血清微载体培养MDCK细胞,并接种流感病毒H1N1,优化培养条件,为细胞流感疫苗的工艺研发奠定基础.采用不同的细胞接种量在50mL无血清微载体搅拌瓶中培养MDCK细胞,并接种甲型流感病毒H1N1,检测不同pH值和TPCK-胰酶含量的病毒培养液,不同病毒接种量,补加TPCK-胰酶,以及不同收毒时间对血凝效价的影响.以1.0×10⁵mL^-1的MDCK细胞数量接种到无血清微载体上,病毒培养液pH值为7.2~7.4范围内,TPCK-胰酶质量浓度为1.0μg/mL,接种后不补加胰酶,病毒接种量MOI=1.0,并在72h收获,最高血凝效价达到512.由此获得了在无血清为载体上培养MDCK细胞和甲型流感病毒H1N1的适宜条件.     

猪轮状病毒的细胞培养

在猴肾传代细胞系（MA－104）上成功培养了猪的轮状病毒。病毒接种前用胰酶处理且维持液中不含血清，连续传代后出现明显的细胞病变（CPE）：细胞先肿大变圆，边界不清，后聚集、萎缩，直到死亡脱落。     

轮状病毒间接免疫荧光的检测方法

以兔抗SA11多克隆抗体为一抗、 Alexa 488标记的山羊抗兔抗体为二抗, 通过对反应条件的优化建立轮状病毒（RV）检测的间接免疫荧光法（IFA）. 实验结果表明, IFA最佳工作条件为: MA104细胞密度为每孔2×10⁴个, 胰酶活化轮状病毒质量浓度为1 μg/mL, 培养时间为18 h, 一抗最适稀释度为1∶800, 二抗最适稀释度为1∶500.     

大肠杆菌内毒素对Vero细胞培养的作用研究

将精制大肠杆菌内毒素(E.COliEndotoxin)加入含血清细胞培养液(MEM)中,配制成浓度分别为50、100、200、500EU/mL的细胞培养液 用此培养液对Vero细胞进行培养,测定细胞生长曲线、细胞平均倍增时间、最大增殖浓度及台盼蓝拒染率等指标,研究大肠杆菌内毒素对非洲绿猴肾细胞(Vero)培养的影响 结果显示,内毒素含量为50EU/mL时,Vero细胞仍能正常生长 当内毒素含量逐渐升高,培养时间逐渐延长时,细胞的增殖速度及活率明显下降 这表明,内毒素对Vero细胞的生长及活性具有明显的抑制作用,且该作用具有一定的时间、剂量依赖性     

茶多酚诱导卵巢癌COC1细胞凋亡的研究

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一,而茶多酚具有抗肿瘤和抗氧化的作用,作者研究茶多酚对体外培养的卵巢癌COC1细胞凋亡的影响.采用不同浓度茶多酚处理卵巢癌COC1细胞,24h后分别采用AO/PI双染法和琼脂糖凝胶电泳法(DNA Ladder),观察和分析茶多酚对COC1细胞凋亡的影响.结果显示,低浓度茶多酚(≤500μg/mL)处理24h后,出现早起凋亡现象;而高浓度的茶多酚(2 000μg/mL)后,出现了明显的晚期凋亡现象;过高浓度(4 000μg/mL)处理,细胞出现死亡现象.不同浓度的茶多酚处理后,细胞均可检测到DNA Ladder,且随着茶多酚浓度的增加,DNA裂解程度加深,电泳中DNA Ladder更明显.实验结果表明,不同浓度茶多酚处理均可以诱导卵巢癌细胞株COC1产生细胞凋亡,研究结果为筛选新型的抗癌药物提供参考.     

不同细胞工厂培养Vero细胞增殖效果

为建立细胞工厂筛选方法,比较市售三个厂家(Corning、Thermo、兰州百灵)细胞工厂培养Vero细胞的生长增殖情况.通过Vero细胞光学显微镜观察、生长曲线、贴壁率、流感病毒增殖对比指标,比较三个厂家细胞工厂培养Vero细胞增殖效果.结果显示,光学显微镜观察三个不同来源的细胞工厂培养的Vero细胞形态变化无明显生长差别,连续传代培养Vero细胞,细胞生长良好.三种不同细胞工厂均能较好促进细胞的生长增殖且细胞生长曲线均呈“S”型;贴壁率分别为(86.20±0.62)%、(94.50±0.70)%、(89.53±0.60)%.甲型H5N1流感病毒感染细胞48 h后,出现明显细胞病变,且血凝效价HA为1∶16,感染性滴度为2.5.三个不同来源的细胞工厂均能支持Vero细胞培养及甲型H5N1流感病毒的增殖,可为细胞工厂筛选提供参考.     

流感病毒胰酶不依赖性的研究

 在无胰酶条件下将流感病毒在MDCK细胞和Vero细胞上连续传代,研究流感病毒生长对胰酶的依赖性.选择出细胞培养流感病毒的适宜pH值,在无胰酶条件下将流感病毒毒株在Vero细胞和MDCK细胞上连续传代,然后将无效价的病毒收获液与原毒种混合后再进行传代.获得了6株在MDCK细胞上无需胰酶就能扩增的流感病毒毒株.     

莪术油对胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影响

研究莪术油影响人胃癌细胞SGC-7901增殖及凋亡的机制。采用台盼蓝拒染法检测不同剂量莪术油对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制率;光学显微镜观察细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA片段化情况;流式细胞术检测细胞线粒体膜电位的改变、细胞凋亡率以及细胞周期分布。实验结果表明：作用48h时,最佳浓度为110μg／mL,IC50值为104．958μg／mL。DNA电泳可见有梯状条带出现,流式细胞术法显示有凋亡峰出现。莪术油可诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡。     

刺参多糖对星形胶质细胞活化作用机制研究

目的探讨刺参多糖对星形胶质细胞的活化作用机制.方法选取新生Wistar大鼠24只,经胰酶消化分离可得星形胶质细胞;采用MTT法检测HS-4对细胞的毒副作用;采用伊红染色与免疫荧光染色检查细胞的形态学变化;采用Western blot法检测细胞特征蛋白GFAP和细胞周期调控蛋白Cyc DI的表达;采用BrdU法检测细胞的增殖;采用Transwell法检测细胞的迁移.结果 HS-4浓度在0.1～100μg/mL,作用时间为3,5 d时,细胞数量与对照组差异不显著,HS-4浓度在100μg/mL,作用时间为7 d时,细胞存活率明显低于对照组,差异显著;体外培养的细胞与HS-4单独作用,细胞形态无明显改变,HS-4与FGF-2联合作用后,细胞形态发生明显改变;星形胶质细胞的特征蛋白GFAP表达水平显著升高,HS-4在1μg/mL和5μg/mL时,GFAP表达升高了169%和183%;对照组细胞周期调控蛋白Cyc DI表达最低,FGF-2单独作用后,Cyc DI表达略有升高,当HS-4与FGF-2联合作用后,Cyc DI表达明显升高;对照组BrdU阳性率最低,占细胞总数的12.9%,FGF-2单独作用后,BrdU阳性率略有升高,占细胞总数的16.4%,与对照组差异不显著,HS-4浓度为1μg/mL和5μg/mL时与FGF-2联合作用,BrdU阳性率明显升高,占细胞总数的28.5%和56.1%,与对照组相比差异显著;静息状态星形胶质细胞无迁移,HS-4与FGF-2作用下星形胶质细胞迁移明显.结论 HS-4与FGF-2能有效诱导星形胶质细胞的活化,其活化机制主要是强化细胞增殖与迁移.     

非膜重组血红素加氧酶系中各分子对血红素降解的作用

利用高效液相色谱分别检测NADPH—细胞色素C还原酶、血红素加氧酶、胆绿素还原酶及三者混合物催化血红素降解的产物.发现由NADPH—细胞色素C还原酶和血红素加氧酶的联合活性使血红素氧化降解产生专一性的胆绿素Ⅸ_α.然后,这种胆色素又被胆绿素还原酶催化还原成胆红素Ⅸ_α,利用Sepharose-4B柱亲和层析,进一步证明上述三种酶之间存在强烈的相互作用,形成酶的三元复合物.这种复合物通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产生原来的三种酶,浓度近似于等摩尔比.     

NDV-Lasota毒株在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性

为探讨NDV-Lasota株在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的增殖特性,采用细胞病变观察、空斑技术、红细胞吸附试验和血凝试验等方法对Lasota株在CEF上的感染特性及其增殖动力学进行检测。结果表明:NDV-Lasota株在添加外源性胰蛋白酶的条件下,可在CEF上有效复制,细胞维持液中胰蛋白酶浓度为25μg/mL时,病毒感染细胞24 h后,红细胞吸附试验呈阳性;30 h后培养上清液血凝效价大于22;48 h后出现明显的细胞病变;72 h后细胞单层上形成边界清晰、圆形的小空斑。     

磷酸奥司他韦-乳铁蛋白吸入剂的制备及HPAEpiC细胞毒性与抑菌作用研究

采用喷雾干燥法制备了磷酸奥司他韦-乳铁蛋白干粉吸入剂。以m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)、溶液体积、进料速率、气体流量为影响因素,以收率、卡尔指数(Carr’s index)、空气动力学直径(D_a)、体外肺部细微粒子沉积率(FPF)为主要指标,设计了4因素3水平的正交试验,对制剂配方及喷雾干燥工艺参数进行优化,得到优化后的制备条件为：m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)=3∶0,溶液体积40 mL,进料速率约6.4 mL/min,气体流量约473 L/h。采用CCK-8法测试在优化条件下制备的干粉吸入剂对正常人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)的毒性,并采用梯度稀释法和菌落计数法测试了干粉吸入剂对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用,结果表明：当干粉吸入剂的质量浓度不高于600μg/mL(所含磷酸奥司他韦的质量浓度约为353μg/mL)时,HPAEpiC细胞的存活率大于90%,表明制备的干粉吸入剂在此浓度范围内对HPAEpiC细胞几乎没有损伤作用;在质量浓度为1 mg/mL时干粉吸入剂对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用,抑菌率为22.50%。     

磷酸奥司他韦-乳铁蛋白吸入剂的制备及HPAEpiC细胞毒性与抑菌作用研究

采用喷雾干燥法制备了磷酸奥司他韦-乳铁蛋白干粉吸入剂。以m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)、溶液体积、进料速率、气体流量为影响因素，以收率、卡尔指数(Carr’s index)、空气动力学直径(D_a)、体外肺部细微粒子沉积率(FPF)为主要指标，设计了4因素3水平的正交试验，对制剂配方及喷雾干燥工艺参数进行优化，得到优化后的制备条件为：m(L-亮氨酸)∶m(甘露醇)=3∶0，溶液体积40 mL，进料速率约6.4 mL/min，气体流量约473 L/h。采用CCK-8法测试在优化条件下制备的干粉吸入剂对正常人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)的毒性，并采用梯度稀释法和菌落计数法测试了干粉吸入剂对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用，结果表明：当干粉吸入剂的质量浓度不高于600 μg/mL(所含磷酸奥司他韦的质量浓度约为353 μg/mL)时，HPAEpiC细胞的存活率大于90%，表明制备的干粉吸入剂在此浓度范围内对HPAEpiC细胞几乎没有损伤作用；在质量浓度为1 mg/mL时干粉吸入剂对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，抑菌率为22.50%。     

RP-HPLC法测定人血浆中的替勃龙

采用反相高效液相色谱法检测人体血浆中替勃龙的含量.以5倍样品体积的乙腈萃取2次,经氮气吹干,甲醇溶解后,上机分析.采用Promosil-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:甲醇-乙腈-水,流速:1.0mL/min,进样量:10μL,检测波长:204nm,柱温:25℃.在优化的色谱条件下,替勃龙在0.5～250.0μg/mL内线性关系良好(r=0.999 9),最低检测限为0.05μg/mL,平均回收率(n=3)为92.7%,RSDs小于1.6%.本方法简单,灵敏,准确,适合于体内替勃龙含量的检测与分析.     

W/O型木犀草素微乳液的制备

制备W/O型木犀草素微乳.以大豆油为油相,选择适当的表面活性剂和助表面活性剂,利用伪三元相图筛选微乳配方,测定了木犀草素在油相和微乳中的溶解度,并考察了木犀草素微乳的初步稳定性.微乳的最佳质量配比为司班∶吐温∶乙醇∶油∶水为4.2∶1.4∶1.4∶3∶1.测定的木犀草素在大豆油、微乳中的溶解度分别为18.127、55.03μg/mL.木犀草素微乳提高了其在油中的溶解度.     

澳洲茄胺盐酸盐的质量控制

研究以高效液相色谱法控制澳洲茄胺盐酸盐质量的方法. 色谱柱为Agilent ZORBAXEclipse XDB-C₁₈柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm), 流动相为V_{甲醇∶V乙腈∶V0.020 mol·L^-1乙酸铵=60 ∶35 ∶5, 流速为1 mL/min, 检测波长为205 nm, 进样量为10 μL. 结果表明, 采用该方法 澳洲茄胺盐酸盐与其他杂质分离良好, 线性 范围5~500 μg/mL(r=0.999 3, 理论塔板数n＞12 000, R＞1.5), 加 样平均回收率为98.6%(n=9), 重现性试验相对标准偏差（RSD）为0.618%.}     

高效液相色谱法测定柯柯豆碱母液中柯柯豆碱、咖啡因的含量

控制提取工艺需要测定柯柯豆碱母液中柯柯豆碱、咖啡因的含量。采用高效液相色谱法测定柯柯豆碱母液中柯柯豆碱、咖啡因的含量 ,以 C8柱为色谱柱 ,以 V(体积分数为 0 .0 0 4 5 %的高氯酸 )∶ V(乙腈 ) =80∶ 2 0为流动相 ,检测波长为 2 80 nm,柯柯豆碱与咖啡因色谱峰的分离度大于 4 ,线性范围为 10～ 80μg/ m L ,相关系数大于0 .999,回收率大于 99.0 %。     

Cell attachment protein VP8* of a human rotavirus specifically interacts with A-type histo-blood group antigen

As with many other viruses, the initial cell attachment of rotaviruses, which are the major causative agent of infantile gastroenteritis, is mediated by interactions with specific cellular glycans. The distally located VP8* domain of the rotavirus spike protein VP4 (ref. 5) mediates such interactions. The existing paradigm is that 'sialidase-sensitive' animal rotavirus strains bind to glycans with terminal sialic acid (Sia), whereas 'sialidase-insensitive' human rotavirus strains bind to glycans with internal Sia such as GM1 (ref. 3). Although the involvement of Sia in the animal strains is firmly supported by crystallographic studies, it is not yet known how VP8* of human rotaviruses interacts with Sia and whether their cell attachment necessarily involves sialoglycans. Here we show that VP8* of a human rotavirus strain specifically recognizes A-type histo-blood group antigen (HBGA) using a glycan array screen comprised of 511 glycans, and that virus infectivity in HT-29 cells is abrogated by anti-A-type antibodies as well as significantly enhanced in Chinese hamster ovary cells genetically modified to express the A-type HBGA, providing a novel paradigm for initial cell attachment of human rotavirus. HBGAs are genetically determined glycoconjugates present in mucosal secretions, epithelia and on red blood cells, and are recognized as susceptibility and cell attachment factors for gastric pathogens like Helicobacter pylori and noroviruses. Our crystallographic studies show that the A-type HBGA binds to the human rotavirus VP8* at the same location as the Sia in the VP8* of animal rotavirus, and suggest how subtle changes within the same structural framework allow for such receptor switching. These results raise the possibility that host susceptibility to specific human rotavirus strains and pathogenesis are influenced by genetically controlled expression of different HBGAs among the world's population.     

HPLC法测定丹聪颗粒中丹参素含量

建立了丹聪颗粒中丹参素的含量测定方法:色谱柱为DiamonsilC18柱,(250 mm×6.0 mm,5μm),流动相为乙腈—水—冰醋酸(9∶160∶1),流速为1.0 mL/min,检测波长280 nm.结果表明:该测定方法快速、准确、灵敏、重现性好,实际测定3批样品,丹参素在0.184~1.656μg范围内进样,线性关系良好(r=0.9994),平均加样回收率为97.91%,RSD%值为1.59%.