大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）RPS24基因cDNA克隆及序列分析

本研究运用RT—PCR技术,首次从大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）的肌肉组织总RNA中成功克隆了RPS 24（Ribosomal Protein S24）基因的表达序列,并对其进行了测序及初步分析．结果表明：大熊猫RPS24基因的表达序列全长为431bp,开放阅读框（ORF）为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的分子量为15．3251kD,pI为10．92,含有7种类型共14个功能位点：即1个N-糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N-酰基化位点、1个酰胺化位点及1个RPS 24e signature．进一步分析发现,大熊猫RP524基因与已报道的人、牛、苏门答腊猩猩、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性：编码序列同源性分别为94．1％、92．4％、94．7％、89．9％和90．4％;与人RPS24蛋白的氨基酸序列同源性为98．48％,其余均为99．24％．     

四川兽类新纪录——秦岭鼢鼠线粒体Cyt b基因的克隆及其比较研究

为揭示2003年在王朗采集的鼢鼠标本王03001号是否为秦岭鼢鼠四川兽类新纪录,以鼢鼠标本王0300号的肌肉组织为研究材料,运用PCR技术对其线粒体Cyt b基因进行克隆和测序．结果表明该基因的长度为1140bp,编码380个氨基酸的蛋白质,所编码的蛋白质含有2个N-糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,6个N-豆蔻化位点．再以已研究的鼢鼠6个种18个体Cyt b基因序列及氨基酸序列为基础数据,把中华竹鼠（Rhizomys sinensis）作为外群,结合本研究的结果构建系统发育树,所得结果不支持王03001号标本为秦岭鼢鼠．     

水稻OsPPDK基因的克隆及生物信息学分析

利用比较基因组学方法,通过小麦TaNAM基因序列来设计引物,在早衰水稻品系金23B中寻找TaNAM的同源基因.对获得的c DNA片段进行序列比对分析,发现其与丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase,PPDK)基因高度同源,因此将其命名为OsPPDK(Oryza sativa PPDK).为进一步探索OsPPDK基因的功能及其与叶片衰老的关系,根据水稻预测OsPPDK基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆出OsPPDK基因的编码区,并进行生物信息学分析.结果表明:该基因全长为3 515 bp,包含一个完整的ORF,编码区长2 844 bp,编码947个氨基酸,分子量为102. 79 k D,所编码的氨基酸序列与其他已知的植物来源的PPDK基因相比,相似性大多在80%以上.在PPDK基因所编码的氨基酸序列中,发现了一个PEP利用酶位点信号,3个N-糖基化位点和15个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪氨酸激酶磷酸化位点和一个PEP利用酶位点.同时推测出多肽链中有规则重复的构象,并同源建模PPDK蛋白整条肽链的三维空间结构.     

大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因（rps15A）的克隆及序列分析

根据已报道的部分物种的核糖体蛋白S15A亚基基因(rps15A)的相关信息设计引物, 运用RTPCR和TouchdownPCR技术, 分别克隆了大熊猫核糖体蛋白S15A亚基的cDNA和结构基因序列, 并进行测序及分析. 结果表明: 大熊猫核糖体蛋白S15A亚基基因的表达序列全长为460 bp,开放阅读框(ORF)为393 bp, 编码130个氨基酸, 结构基因序列全长为6091 bp, 含有4个外显子和3个内含子. RPS15A蛋白的相对分子质量为14.84 kD, pI为10.62. 拓扑预测显示含有5个类型的功能位点, 即: 1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点, 2个蛋白激酶C磷酸化位点, 1个乙酰化位点, 1个N 糖基化位点及1个核糖体蛋白S8 signature位点. 进一步对RPS15A蛋白的结构分析及其与部分脊椎动物和果蝇RPS15A蛋白的同源性分析, 发现该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列具有很高的相似性, 这表明真核生物核糖体蛋白亚基S15A在进化中具有较高的保守性.     

水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及检测

以水稻（粳稻）cDNA为模板,设计一对特异性引物,获得编码水稻高亲和力磷酸盐转运蛋白基因的全序列,ORF区编码含535个氨基酸的蛋白,具有磷酸盐转运蛋白保守的蛋白激酶C作用位点、N端糖基化位点与酪蛋白激酶Ⅱ作用位点Southern blot分析显示此基因在水稻基因组中具有多个拷贝,与水稻基因组序列分析结果一致Westernblot预测目的基因表达的蛋白大小约为57．7ku．该基因的真核表达研究正在进行中．     

沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因的分子进化

运用生物信息学分析手段和在线数据库,对沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因进行综合分析。结果显示:该基因全长为1 562 bp,开放读码框为1 152 bp;编码383个氨基酸,分子量为44 010.5道尔顿;等电点为8.63,带正电荷侧链的氨基酸与带负电荷侧链的氨基酸比例为29∶34;氨基酸组成中亮氨酸占10.7%,缬氨酸占7.8%,丙氨酸占6.8%;不稳定指数为36.73,脂肪指数为89.58,总平均疏水指数为-0.016,为亲水蛋白;其二级结构以无规则卷曲与折叠为主,属膜蛋白,有3个酪氨酸激酶II磷酸化位点、2个N-肉豆蔻酰化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、3个N-糖基化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个微体C-端定位信号;该蛋白为质膜-脂肪酸去饱和酶域超家族蛋白(Membrane-FADS-like superfamily)。功能预测分析结果显示与其他物种的该去饱和酶特性相一致。     

山羊GDF9基因编码区nsSNPs的生物信息学分析

为筛选山羊GDF9基因的功能性nsSNPs,利用生物信息学技术对该基因编码区nsSNPs进行了有害位点的预测,进一步对有害nsSNPs在GDF9蛋白的位置、进化保守性及其对编码蛋白的稳定性、高级结构的影响等进行了预测分析,同时分析了该蛋白的泛素化修饰位点和磷酸化修饰位点.结果 表明,山羊GDF9基因编码区14个nsSN...     

大熊猫核糖体蛋白RPL5基因的克隆、表达与比较分析

为了解大熊猫(Ailurophilic melanosome)核糖体蛋白亚基RPL5基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPL5基因的异同,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中和DNA中分别对核糖体蛋白亚基RPL5基因的表达序列和其结构基因进行了克隆、测序;采用ORF finder软件对表达序列的开放阅读框(ORF)进行了查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因进行了分析;采用DNAMAN Version 6对基因序列和氨基酸序列进行了同源性比较;采用ExPASy软件进行蛋白质功能位点和生化特性进行了预测分析;对大熊猫核糖体蛋白亚基RPL5基因进行了超表达实验.结果表明:大熊猫RPL5结构基因长为8 633bp,具有8个外显子和7个内含子;mRNA长为918bp,ORF为894bp,编码295个氨基酸,该蛋白的相对分子质量为34 402.6,等电点为9.73,含有1个依赖于AMP和GMP的蛋白激酶磷酸化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,8个十四(烷)酰化位点.分析表明,大熊猫RPL5基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物包括人(Homo sapiens)、牛(Bos Taurus)、猪(Sus scrofula)、小家鼠(Mus altocumulus)和褐家鼠(Rat-hauser nonstrategic)具有很高的相似性,大熊猫RPL5核苷酸序列与这些物种的相似性分别为94.52%、92.51%、91.95%、91.05%和89.15%,而氨基酸序列相似性分别为99.33%、98.65%、98.65%、98.32%和98.65%.超表达实验结果显示:大熊猫RPL5基因能在大肠杆菌BL21中有效表达,且在2h时达到表达高峰.运用分子生物学原理与相应的技术手段,成功地扩增出大熊猫RPL5基因的表达序列,并对其编码的蛋白进行了初步分析,丰富和完善了哺乳动物RPL5基因资料库,同时也为深入研究大熊猫RPL5基因的功能提供了相关基础数据.     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genescan软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶II磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

甘蔗抗坏血酸过氧化物酶的电子克隆及生物信息学分析

电子克隆是随着EST计划和生物信息学发展起来的基因克隆策略。运用电子克隆的方法获得甘蔗S-APX2基因。以水稻中一个基因OsAPX2为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行预测和分析。获得一个甘蔗APX基因S-APX2的cDNA序列全长,该序列长1110bp,包含一个完整的975bp的ORF,编码324个氨基酸;属于疏水性蛋白,编码蛋白含有Heme binding site,Substrate binding site,K+binding site,Ascorbate-peroxidase结合位点和保守域,属于Plant-peroxidase-like Superfamily家族;亚细胞定位分析显示,编码蛋白位于植物细胞的线粒体中。具有5个丝氨酸磷酸化位点,9个苏氨酸磷酸化位点以及1个酪氨酸磷酸化位点;存在信号肽但是无跨膜结构域,二级结构由30.74%α螺旋、13.92%延伸链和40%无规则卷曲组成;且与水稻、玉米等其他植物的APX具有高度的同源性。电子克隆获得了完整的甘蔗APX基因全长cDNA。     

四川黑熊ND3、ND4L和tRNA-Arg基因的克隆和序列分析

克隆并测定了四川黑熊（Ursus thibetanus mupinensis）线粒体基因组764 bp的片段,根据序列同源性比较,该DNA片段包括2个蛋白质编码基因：ND3和ND4L基因,以及1个tRNA-Arg基因.四川黑熊的ND3基因和ND4L基因的DNA序列和所编码的氨基酸序列与马来熊、棕熊、美洲黑熊和北极熊的同源性分别为：90%和95%、93%和97%、91%和96%、93%和97%;89%和98.98%、88%和98.98%、89%和100%、89%和98.98%.与棕熊、美洲黑熊和北极熊tRNA-Arg（CGA）的同源性分别为95.65%、94.20%和94.20%.拓扑结构比较显示,四川黑熊的ND3基因所编码的氨基酸序列比美洲黑熊的少了1个蛋白激酶C磷酸化位点.     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

绵羊KAP1.1基因编码蛋白生物信息学分析

为了探究KAP1.1基因(keratin-associated protein 1-1)潜在的生物学功能,利用分子生物学软件对绵羊KAP1.1基因编码蛋白进行了生物信息学分析。结果表明,该基因共编码182个氨基酸,为一可溶性不稳定蛋白。分子量为18 788.45 u,等电点为6.03。另预测得知该蛋白含有6个磷酸化位点,无糖基化位点,不含有跨膜区和信号肽,推测其不是一个分泌型蛋白。亚细胞定位绵羊KAP1.1蛋白主要在线粒体和细胞核中发挥生物学功能,二级、三级结构显示,无规则卷曲是构成该蛋白的主要结构元件。物种间同源性分析显示,绵羊KAP1.1蛋白氨基酸组成与牛的相似度最高(85.9%)。     

多房棘球绦虫钙网蛋白结构和功能的生物信息学研究

为进一步研究多房棘球绦虫的致病性、药物靶点以及疫苗诊断试剂的开发提供理论依据,应用生物信息学方法预测分析多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的结构和功能。通过基因组数据库收集数据确定Em-CRT基因和氨基酸序列;利用生物信息学软件分别对Em-CRT进行蛋白质基本性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二/三级结构、亲/疏水性、抗原表位以及进化关系等进行预测和分析。结果表明:Em-CRT基因转录本长度为1 188 bp,蛋白全长为395个氨基酸残基,分子量大小约为45.44 kDa,等电点(pI)为4.47,为稳定蛋白,亲水性较高,可溶于水;具有信号肽和信号肽酶剪切位点,为膜外蛋白;Em-CRT具有N端糖基化位点,酪氨酸激酶(TK)Ⅱ磷酸化位点,cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,N端肉豆蔻酰化位点,蛋白激酶C磷酸化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点;二级结构以无规则卷曲和α螺旋为主;Em-CRT具有良好的T,B细胞抗原表位。所以,Em-CRT对多房棘球绦虫个体发育具有重要的作用,且与多房棘球蚴感染免疫密切相关,可参与感染过程或宿主免疫应答,具有作为诊断试剂抗原分子的价值和潜在的疫苗候选分子与新的药物靶标的应用前景。     

马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的生物信息学初步分析

本文根据马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的EST序列,运用多种生物信息学方法,对其进行初步的生物信息学分析.电子克隆获得了该基因的全长,结果表明:该序列全长1 742 bp,共编码357个氨基酸,有多个限制性酶切位点,有多个磷酸化位点,属于亲水性氨基酸,无信号肽,有膜穿透性.通过蛋白质二级结构功能域的预测,发现该序列中含有11个功能位点.通过蛋白质同源序列比对,发现该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因相似度极高,暗示该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因具有相似的生物学功能.以上结果可以为进一步研究该基因在马铃薯中特别是在抗青枯病分子育种中的功能提供相关依据.     

沙田柚S-RNase基因的克隆及序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序。通过差异分析得到沙田柚S-RNase基因序列。该基因全长为1 238bp(GenBank登录号为KP172529),开放阅读框(ORF)全长为834bp,共编码278个氨基酸,编码的蛋白质的相对分子质量为31.402kDa,理论等电点为5.30。S-RNase蛋白为亲水性蛋白,共有17个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与柚Citrus maxima、沙糖桔Citrus reticulata和甜橙Citrus sinensis的同源性分别为99%、98%和96%。系统进化树显示沙田柚S-RNase基因与柚、沙糖桔和甜橙亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

药用植物黄花蒿ATP合成酶电子克隆及生物信息学分析

本文通过电子克隆的方法获得黄花蒿ATP合成酶的基因完整序列并对该蛋白特性进行相应分析.以Accession number KJ434435.1为探针,对黄花蒿的EST数据库进行搜索,获得同源较高的序列,用相关生物软件DNAMAN、MEGA进行拼接组装,并对获得核苷酸和氨基酸进行生物信息学分析.结果发现获得黄花蒿ATP合成酶基因拼接群1963bp,含有一个完整的开放阅读框(ORF)序列(1479bp),编码492个氨基酸,该蛋白质含15个α螺旋,23个β折叠及27个无规则卷曲.黄花蒿ATP合成酶蛋白的分子质量为52830.4,分子式为C_(2342)H_(3778)N_(636)O_(721)S_(14),理论等电点为5.18,该蛋白的GRAVY值为-0.048,具有亲水性的水溶性蛋白.该蛋白质序列有丝氨酸磷酸化位点(Ser)9个、苏氨酸磷酸化位点(Thr)6个、酪氨酸磷酸化位点(Tyr)4个.通过分析获得黄花蒿ATP合成酶完整的c DNA序列,该氨基酸序列不存在信号肽,无跨膜现象、非分泌型蛋白,为黄花蒿ATP合成酶实验室研究提供一定的理论基础.     

桃钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶基因家族鉴定与分析

钙调磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CIPKs)在植物生长发育和抗逆过程中发挥着重要作用。为了对桃中CIPK家族基因进行系统分析,利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CIPK家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有18个CIPK基因,分布于桃的6条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CIPK蛋白均含有2个保守的PKinase和NAF结构域。进化树分析表明CIPKs可分为2个亚家族。Net Phos 2.0 Server结果显示Pp CIPKs存在着大量的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示桃CIPK蛋白的功能提供重要的理论基础。     

梅花鹿抗病毒蛋白的生物信息学分析

通过在线生物软件分析梅花鹿四种抗病毒蛋白A3Z2、BST-2A、BST-2B和SAMHD1蛋白的生物信息学特性。从转录组中获得四种蛋白的基因序列,应用Prot Param、Protscale、SOPMA、TMHMM、Target P、Signal P、Motif Scan、Interproscan以及BLAST等在线软件分析蛋白的理化性质、二级结构、穿膜域、结构域等等。首次获得了四种抗病毒因子的基因和蛋白序列,梅花鹿A3Z2基因编码393个氨基酸,相对分子质量为47.59 k Da,碱性,不稳定性亲水蛋白,无信号肽和跨膜结构域,胞内定位,具有糖基化和磷酸化位点,两个胞嘧啶脱氨酶结构域。梅花鹿BST-2A和2B基因编码159个氨基酸,相对分子质量为17.69 k Da和18.12 k Da,酸性,不稳定性亲水蛋白,无信号肽,BST-2A有两个跨膜结构域,BST-2B有一个跨膜结构域,膜定位,具有糖基化和磷酸化位点。梅花鹿SAMHD1基因编码613个氨基酸,相对分子质量为70.51 k Da,碱性,不稳定性亲水蛋白,无信号肽和跨膜结构域,胞内定位,具有磷酸化位点,d NTP磷酸水解酶活性结构域。梅花鹿A3Z2、BST-2A、BST-2B和SAMHD1蛋白具有潜在的抗病毒能力。