培养基组成对里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影响

通过改变产酶培养基中的营养成分与比例,采用酶活力测定方法,分析培养基中的碳源种类和浓度、氮源组成、碳氮比(mC:mN)等主要因素对里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的影响。结果表明,20 g/L微晶纤维素为碳源、含氮素质量比为1∶1的硫酸铵和尿素为氮源、mC:mN=4的培养基组成,是里氏木霉合成β-甘露聚糖酶的最佳条件。在此条件下β-甘露聚糖酶酶活力在发酵96 h时达到最大,β-甘露聚糖酶酶活力和β-甘露糖苷酶酶活力分别为4.48、0.04μmol/(min.mL)。     

K148与K149对黑曲霉NRRL3135植酸酶A与植酸结合机制的影响

为了研究黑曲霉NRRL3135植酸酶A K148与K149对底物与酶的结合反应的影响,构建了一个单位点突变体(K148E)和一个双位点突变体(K148E和K149E),由于带电的氨基酸残基发生变化,造成这2个突变体的酶活性都有不同程度的减少,利用InsightII软件模拟了2种突变体酶的3-D结构,发现酶分子突变位置的表面电势有明显的改变.这2个α-螺旋(141～160)位点的改变可能降低了活性中心附近的底物浓度,减缓了底物与活性中心的反应速度.     

人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到全长1 761bp的HsCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA-HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和PCR检测获得重组质粒BacmidHsCRY1,转染昆虫Spodoptera frugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS-PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100mmol/L及200mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.31P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒-昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.     

人工脱色过氧化物酶催化降解苋菜红活性研究

以肌红蛋白(Mb)为骨架构建并纯化了三突变体蛋白F43Y/F138W/P88W Mb,双突变体蛋白F43Y/F138W Mb及单突变体蛋白 F43Y Mb,并对三个突变体蛋白的苋菜红(amaranth)脱色降解活性进行了研究。催化活性及酶动力学研究结果显示,相比于F43Y/F138W Mb和F43Y Mb,三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的苋菜红催化效率最高,这表明色氨酸对人工脱色过氧化物酶的活性起了重要作用。该研究不仅为今后的血红素蛋白设计提供了理论依据,同时也表明人工酶在染料废水处理方面具有潜在的应用价值。     

大豆斑疹病菌内切甘露聚糖酶ManA的功能研究

为探析大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv.glycines,Xag)基因组中唯一注释编码内切甘露聚糖酶(mannan endo-1,4-β-mannosidase,ManA)基因是否参与Xag的内切甘露聚糖酶活性及其他功能,采用同源重组策略创制了Xag的manA基因缺失突变株(ΔmanA)...     

H-蛋白中Asp-68和Tyr-70定向突变对甘氨酸裂解酶系整体酶活的调控

还原甘氨酸途径被认为是最有前景的C1（one carbon）合成途径,其核心酶系是甘氨酸裂解酶系。在前期研究中,我们在甘氨酸裂解酶系H-蛋白“解开自保护”过程的研究中初步锁定了H-蛋白空腔内的潜在关键氨基酸残基为Ser-67、Asp-68和Tyr-70,并且证明Ser-67位点对甘氨酸酶系的整体酶活有重要影响。本文对H-蛋白的Asp-68和Tyr-70位点进行了侧链带正电突变（H-D68K、H-D68H、H-D68R和H-Y70K、H-Y70H、H-Y70R突变体）,以及侧链非极性突变（H-D68G、H-D68V、H-D68M、H-D68L和H-Y70G、H-Y70V、H-Y70M、H-Y70L突变体）,并测定了各突变体在甘氨酸裂解方向上的酶活。结果发现,Asp-68位带正电突变倾向降低甘氨酸酶系的整体酶活,Asp-68位非极性突变、Tyr-70位带正电突变及非极性突变在总体上倾向于维持或提升整体酶活。其中,相对野生型H-蛋白,H-D68R突变体的酶活下降了90.2%,H-Y70R、H-D68G和H-Y70L突变体的酶活分别提高了75.6%、53.6%和146%。硫辛酰胺与H-蛋白空腔内的氨基酸相互作用的分析结果表明,甘氨酸裂解酶系整体酶活的变化是由于H-蛋白的68和70位残基的突变阻碍或促进硫辛酰胺的释放。     

集胞藻PCC6803基因slr2049定点突变及其体内重组功能研究

在Synechocystis sp.PCC 6803中找到与cpeS具有高度同源性的基因slr2049.采用PCR从Synechocystis sp.PCC 6803DNA中扩增出cpcB,slr2049,ho1,pcyA4个基因;定点突变试剂盒构建8个突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(A24S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(R107S)和slr2049(Y124S);将它们与表达载体pCDFDuet-1和pET-23a(+)相连构建pCDF-cpcB-slr2049野生型和pCDF-cpcB-slr2049突变体以及pET-ho1-pcyA,进行高效表达,用亲和层析柱纯化,产物用SDS-PAGE和光谱检测.研究表明:突变体slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(Y124S)与野生型slr2049催化获得的重组藻蓝蛋白β亚基具有与天然藻蓝蛋白β亚基相似的光谱特性,其他2个突变体slr2049(A24S)和slr2049(R107S)催化的产物则没有光谱特性.由此推测,第24位丙氨酸和第107位精氨酸可能是slr2049酶活性的必需氨基酸,其所处位置是slr2049的活性位点.     

马铃薯贮藏蛋白Patatin及其突变体分子动力学和分子对接的研究

马铃薯贮藏蛋白Patatin具有水解脂肪的能力,且特定位点的突变能够影响Patatin的水解酶活性.Patatin的水解酶活性中心是由Ser77和Asp215组成,首先采用分子动力学方法研究Patatin及其突变体的稳定性和构象变化,通过结构比对没有发现构象规律性的变化,然后采用分子对接方法,发现了两个基团(Patatin及其突变体活性位点Ser77的羟基与底物p-硝基苯基癸酯的酯键)间的距离具有规律性:即H109A和D182A(活性减弱)两个基团之间的距离偏大,而R368A,E140A,H109N(活性增强)两个基团之间的距离偏小,符合之前的生化数据.这说明Ser77的羟基与底物PNPC10的酯键间的距离可能能够影响底物小分子与Patatin蛋白的结合,从而影响Patatin酯酶的活性.同时,根据细胞内溶质磷脂酶A2(cPLA2)反应过程,我们推测了Patatin与底物之间可能的催化机制.     

环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究

本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。     

阿特拉津氯水解酶基因的定点诱变和酶活力检测

阿特拉津氯水解酶(AtzA)是一种对除草剂的生物降解和环境净化有重要意义的酶．采用定点诱变方法将假单胞菌ADP株的atzA基因第832位碱基(鸟嘌呤)诱变成腺嘌吟，然后将其插入表达载体pET21b( )，并在大肠杆菌中表达．表达的蛋白特性研究表明：AtzA或AtzA—NK融合蛋白系水溶性蛋白，很容易通过Ni—NTA Magnetic Agarose Beads分离纯化．采用阿特拉津脱氯反应产生HCl而引起pH指示剂颜色改变的测定方法能方便地对其酶活力进行定量．酶活力结果表明，突变酶的比活力与假单胞菌ADP菌株的AtzA相比没有明显改变，暗示突变位点(第278位缬氨酸突变成甲硫氨酸)不是酶的活性中心或底物结合部位。     

马克斯克鲁维酵母表达系统菊粉酶启动子的改造及活性研究

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)作为一种食品安全级酵母,具有生长快,生物量高等特点,是一种新型的重组蛋白表达的宿主系统.启动子是供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列,调控着转录的起始过程,直接影响基因的表达水平.本文通过易错PCR技术对马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子Pinu进行两轮突变,以阿魏酸酯酶(Est1E)作为报告基因,经筛选、鉴定获得了5个可以显著提高外源蛋白表达量的突变型启动子Pm1D81、Pm1F138、Pm2Q89、Pm2M73、Pm2X47,报告蛋白Est1E的酶活性是启动子改造前的2.31,2.65,5.01,5.40,5.43倍.随后测试了启动子Pm2X47对外源蛋白甘露聚糖酶和赤霉烯酮降解酶表达的影响,结果显示这两种酶的表达量均有提高,分别是启动子改造前的3.57倍和4.13倍.上述结果提示,改造后的菊粉酶启动子在提高外源蛋白表达水平方面具有一定的通用性,可作为新型候选表达元件,以提升马克斯克鲁维酵母重组表达外源蛋白的能力.     

耐热β-半乳糖苷酶(Pyrococcus furiosus DSM 3638)活性位点N415S点突变对其酶活性的影响

β-半乳糖苷酶具有将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖的能力,也具有把半乳糖聚合成低聚半乳糖的能力。这两种能力在工业生产中具有不同的意义。通过点突变使β-galactosidase[Pyrococcus furiosus DSM 3638]415位天冬酰胺(Asn or N)突变为丝氨酸(Ser or S),突变体构建于毕赤酵母表达质粒载体,并筛选以毕赤酵母为宿主细胞的工程菌种,以此制备β-半乳糖苷酶的突变体酶蛋白。研究发现,该突变体的β-半乳糖苷酶活性在95℃、p H5.5时达到最高酶活,为耐高温乳糖酶,且该突变体水解牛奶的能力较好,可用于低乳糖牛奶及其相关制品加工中。而突变后β-半乳糖苷酶的另一个活性,即产生低聚半乳糖的能力的活性也有所提高,但不够明显。因此该位点突变可用于乳制品的加工,但不能期盼产生更多的半乳糖寡聚体。     

定点突变提高豆豉纤溶酶的酶活力和底物特异性的研究

以pBE—DFE质粒为模板,采用反向长距离PCR技术对豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme,DFE)基因进行定点突变,使位于酶的底物结合区第156位的谷氨酸和第166位的甘氨酸分别替换为丝氨酸和丙氨酸,使临近酶的底物结合区的第169位甘氨酸残基替换为丙氨酸,获得了三个突变体E156S,G166A和G169A.将含突变基因的表达载体转化枯草杆菌WB800,构建了豆豉纤溶酶基因突变体的表达菌株WB800(E156S);WB800(G166A)和WB800(G166A).将3种表达菌株进行液体发酵培养,结果发现发酵上清液中纤溶酶的纤溶活性为460,790和900U/mL,分别是未突变酶活性(660U/mL)的70%,115%和136%;3种突变酶对合成底物的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的酰胺水解活性是未突变酶的17%,125%和121%.     

小麦TaUBC基因泛素结合酶活性分析

已报道的RNA水平研究表明TaUBC可能是小麦产量相关基因,生物信息学分析显示该基因属于泛素结合酶家族.荧光定量PCR显示TaUBC在小麦根茎叶中均有表达.为了验证TaUBC蛋白是否具有泛素结合酶活性,本文利用原核系统表达野生型TaUBC及三种点突变TaUBC~(C21S)、TaUBC~(C85S)、TaUBC~(C107S)蛋白,并对这些蛋白进行体外泛素化活性分析.结果证实TaUBC是一个有活性的泛素结合酶.另外,点突变C85S使得TaUBC丧失E2活性,C21S和C107S则对活性没有影响,证明其UBC结构域中第85位Cys是结合泛素的关键作用位点.     

用点突变方法研究海参精氨酸激酶的活性位点

为研究动物能量代谢,用点突变的方法从双亚基海参(Stichopusjaponicus)精氨酸激酶中得到了3个突变体:C274A、R283G和H287A,并通过大肠杆菌E.coli表达。大部分精氨酸激酶都以包涵体的形式存在。经过纯化之后对3种突变体的催化活性和一些结构特征进行了分析。这3种突变体丧失了绝大部分催化活力,特别是突变体C274A,与野生型相比除了活性完全丧失之外,结构却几乎没有变化。这3个残基对海参精氨酸激酶结构或功能的保持有着重要作用,Cys274残基可能是海参精氨酸激酶的活性位点。     

小麦蜡质突变体Wx蛋白突变基因的分子鉴定

蜡质型小麦面粉对于改善面食品的加工品质、适口性、风味特点和延长货架寿命具有重要意义.淀粉粒结合型淀粉合酶I被称为蜡质蛋白(Waxy Protein,简称为Wx蛋白),是决定胚乳中直链/支链淀粉比例的关键酶.Wx基因发生突变并不影响产量等其它性状的表现.小麦三个Wx基因位点中Wx-D1的天然突变型遗传资源非常稀有.本实验对EMS诱导扬麦158的6个蜡质型突变体及其子代系进行了基于PCR的遗传多态性分析、单粒种子Wx蛋白SDS-PAGE电泳鉴定、PCR产物的克隆分析.利用自行设计的引物为5个突变体子代找到了STS标记;查明了两个突变体突变位点及其突变方式,是新的突变方式.     

转β-甘露聚糖酶基因大肠杆菌在猪肠道内的外泌型表达

从里氏木霉R u t C-30提取总RNA,用RT-PCR方法克隆到β-甘露聚糖酶成熟肽cD-NA,并将其E coRΙ和B amH I酶切后连接到克隆载体pGEM进行测序,结果与G enB ank公布的完全一致,随后将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pGEM-M anΙ经E coRΙ、绿豆芽核酸酶、H indⅢ酶切处理和纯化后,与含有Ω序列和T 7启动子以及信号肽Om pT序列的分泌型表达载体pTOO 2连接,构建成表达载体pTOO 2-M an.Ι然后利用大肠杆菌素释放基因(k il)能有效的增加细菌外膜通透性促进周质蛋白外泌的原理,再将表达载体pTOO 2-M anΙ和质粒pUC 18-k il共转化到大肠杆菌BL 21株中,构建成外泌型表达体系BL 21-pTOO 2-M anΙ/pUC 18-k il进行外泌型表达.表达产物经酶活鉴定具有明显的β-甘露聚糖酶活性,经EL ISA双抗夹心法检测,无论在体外或猪肠道内容物内均为阳性,从而实现了该基因的外泌型表达;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,分子量为50.98 kD和53.98 kD,该工程菌通过瘘管灌注到猪肠道内进行表达研究,结果基本令人满意.从而实现了该转基因大肠杆菌在猪肠道中外泌型表达的目的.     

构建T载体用于PCR克隆

通过克隆甘露聚糖酶基因到pMD-18T载体构建了质粒pMD-18Tman2XcmI,克隆的甘露聚糖酶基因两侧各引进了一个特定的XcmI酶切位点;用XcmI酶切质粒pMD-18Tman2XcmI可以制备T载体．因为甘露聚糖酶基因作为填充片段和筛选标记受半乳糖苷酶基因启动子的控制,甘露聚糖酶能够表达,从而水解甘露聚糖产生水解圈,指示转化了部分酶切质粒的背景菌落．此外,在甘露聚糖酶基因中存在第3个不同序列的XcmI酶切位点,因此残余的甘露聚糖酶基因引起的背景可以进一步降低．抽提大量质粒贮存,随时制备T载体使用,增加了克隆的稳定性．该T载体克服了一般T载体质量不稳定,费钱,克隆效率低,假阳性高的缺点．使用构建的T载体完成了10个基因的克隆,结果表明重组效率达到了90％～100％．     

锌指蛋白ZNF191(243-368)G321A;N324L;G321A/N324L突变体的制备和表征

通过分子生物学的蛋白质工程方法对锌指蛋白ZNF191(243—368)的第三锌指区(Gly321和Asn324进行了定点突变，在大肠杆菌BL21中表达，通过DEAE52，CM23，肝素柱CL-6B纯化，最终获得了ZNF191(243—368)(G321A；N324L；G321A／N324L等3个突变体蛋白，运用凝胶电泳、UV光谱、EDTA滴定、金属离子(Co^2’，Ni^2 )取代等方法对突变体蛋白进行了初步表征，这为今后进一步研究该蛋白的结构和功能提供了必要的物质基础。     

具有抑制糖苷酶和胰蛋白酶双重活性的亚麻多肽的大肠杆菌重组表达及其活性分析

亚麻胰蛋白酶抑制剂(Linum usitatissimum L.LUTI)是亚麻中一种兼具胰蛋白酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂双重活性的多肽。文章将LUTI基因连接在pGEX-6p-1载体上获得重组载体pGEX-6p-1-LUTI,转化至大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)表达,经GST-Sepharose4B、Prescission Protease酶切GST标签、Sephacryl S-200凝胶层析,获得分子量大小为8kDa电泳纯的重组LUTI(rLUTI)。经抑制活性测定,相比天然的LUTI,rLUTI对胰蛋白酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性明显提升。二硫键存在与否对两种酶的抑制活力均有影响。利用定点突变技术获得rLUTI的C4/A,C49/A,C4、49/A突变体,进一步双酶抑制活性及CD结构分析显示,rLUTI的C4/A、C49/A及C4、49/A突变体对胰蛋白酶抑制活性影响尤为明显,α-葡萄糖苷酶的抑制活性略微下降;其中rLUTI的C49/A及C4、49/A突变体完全丧失了对胰蛋白酶的抑制活性。C4/A的突变对rLUTI的二级结构影响最为明显,导致α螺旋结构含量的降低。以上结果表明rLUTI第4位氨基酸Cys是影响其二级结构的关键位点,第49位氨基酸Cys则在维持其双酶抑制活性上发挥着重要作用,特别在胰蛋白抑制活性方面尤为突出。