家养动物的遗传工程:来自鼠遗传模型报告

本文对从转基因鼠所得到的大量观察进行了报道,以便检验将基因直接导入家养动物的可行性。外源基因的组织特异的或一般的表达已经实现,并且有证据表明它可与内源基因相配合进行活动,这些结果表明参与某些有动物技术价值的特征行为(如食物消化,泌乳,免疫反应)的器官(如肝、乳腺)或组织(如外分泌腺、B淋巴细胞)的活动,通过基因转移得到适当的促进。目前,偶而也能观察到外源基因的异常表达或传递;有时转基因动物的生殖力会严重下降。这些失控行为及至今尚在使用的将基因导人生殖系的低效率方法,对于基因工程在家养动物中的应用仍是一个主要的障碍。     

猪细胞视黄醇结合蛋白基因1（CRBP1）内含子1的克隆测序

类维生素A(维生素A及其代谢产物)在动物的视觉、生长、繁殖、细胞的分化及胚胎发育等方面起重要作用.猪细胞视黄醇结合蛋白基因1(CRBP1)属于猪视黄醇结合蛋白基因家族(CRBPs).本研究将猪细胞视黄醇结合蛋白基因1(CRBP1)的内含子1进行了克隆测序,其大小为453bp.为进一步研究猪CRBP1基因的全序列奠定了一定的基础.     

粘质沙雷氏菌抗铜基因的克隆及性质研究

 通过构建粘质沙雷氏菌KMR-3菌株的基因组DNA文库,克隆到了与该菌的铜抗性相关的基因,并对其部分特性进行了研究.结果表明克隆到的铜抗性基因所编码的蛋白属于CutF蛋白,由194个氨基酸编码,与莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC43969抗铜脂蛋白NlpE同源性最高,达到70%,并对该基因的调控序列(启动子、终止子、SD序列及转录起始位点)进行了分析.     

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构，明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能，选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间，设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上，利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况，鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系，敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础，同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。     

家蚕生物反应器与家蚕实验动物化饲育技术

以家蚕为生物反应器 (重组家蚕核型多角体病毒表达系统 )生产基因工程产品 ,具有成本低、安全、产品产量与活性高的优点。随着近年生命科学和生物技术的迅猛发展 ,需要发展新的实验动物品种、特别是利用低等动物代替哺乳动物 ,大力开发动物资源型功能 ,造福人类。本文报道我所利用家蚕表达外源基因与家蚕实验动物化饲育技术方面一些研究成果。由家蚕细胞、转移载体、修饰的BmNPV、家蚕幼虫或蛹组成家蚕表达系统。获得了含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的重组病毒 (rsj14NPV)和含有日本血吸虫 2 8KDGST基因的重组病毒 (rsj2 8NPV)。r…     

斜带石斑鱼ERP44基因的克隆与表达分析

为进一步了解内质网蛋白44基因(ERP44)在石斑鱼免疫反应中的作用,本研究根据实验室石斑鱼转录组数据中ERP44的表达序列标签(EST)设计引物,克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)Ec-ERP44基因的开放阅读框序列(ORF),利用生物信息学手段分析Ec-ERP44基因及其编码蛋白的序列结构和特征,并通过实时荧光定量PCR检测该基因的组织分布特征,以及脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly I:C)刺激后该基因在石斑鱼脾脏中的表达变化。研究结果表明,Ec-ERP44基因ORF全长1 233 bp,编码410个氨基酸;该蛋白具有蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族保守的硫氧还蛋白结构域。同时,Ec-ERP44基因在健康石斑鱼体内的多种组织均有表达,其中在脑组织中的表达量最高;在LPS与Poly I:C刺激后,石斑鱼脾脏中Ec-ERP44基因的表达显著上调。本研究结果表明,Ec-ERP44基因参与了石斑鱼抗病原感染的免疫反应。     

油葵种子特异性基因HaAP10启动子克隆及功能验证

为研究植物脂质转移蛋白基因HaAP10启动子能否在油葵种子中驱动外源基因特异性表达,从油葵(Helianthus annuus L.)基因组DNA中采用PCR技术克隆了HaAP10基因上游的调控序列964bp.序列分析结果表明,964bp核苷酸序列与报道序列同源性99%,包含TATA-box等基因表达的重要特征元件及种子特异表达所必需的核苷酸序列.将其与β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因融合构建植物表达载体,并利用花粉管通道法转化油葵获得转基因植株,通过PCR鉴定和组织化学染色进行分析.PCR扩增初步证明目的片段已整合到油葵基因组中,组织化学分析表明HaAP10基因启动子能够驱动GUS基因在种子中特异表达,而在根、茎和叶中无GUS活性.结果表明HaAP10基因上游964bp片段可驱动外源基因在油葵种子中特异性表达,具有种子特异性启动子的功能,为油葵植物生物反应器的构建提供了优良的基因资源,同时也为油葵的油脂基因工程改良提供了基因资源.     

动物饲料中的抗生素与人类疾病

约在四十年前 ,抗生素就已经被人们用于动物饲养和畜牧业 ,因为在肠道中的产气荚膜杆菌等产生的毒素被认为是阻碍动物生长的主要原因 ,而使用抗生素后可以有效地抑制这些阻碍动物生长的细菌 ,从而促进动物的生长 ,因其效果好而被广泛地应用现在。由于有食品及药物管理组织 (FDA)的规定 ,因此到消费者手中的肉和奶的抗菌药物残量并不太高。然而由于长期使用抗生素 ,使得一些细菌 (正常菌、致病菌 )都逐渐产生了耐药性。(一 )人类的危机一些细菌如沙门氏菌和李斯特菌 ,可以通过动物的肉或奶传播到人体内。1888年 ,德国首次报道有约 5 0人因…     

欧美爆发转基因食品战

从本世纪80年代世界上第一例转基因植物的诞生,到目前全世界约有2780万公顷的转基因作物,到诞生转基因动物生物反应器大量的生产医用蛋白,人类将最新的生物技术应用于医药、食品、农业领域,以摆脱自然对传统作业的限制。 转基因植物是把来源于任何生物甚至人工合成的基因转入植物,这可能是自然界无法发生的,人们也无法预测基因进入一个新的遗传背景中会产生什么样的作用。转基因动物,一是将正常人的基因片断导入动物体内,让这种基因在哺乳动物体内表达,并通过该动物分泌的奶或其他组织,提取获得具有活性的分泌物质,获得大量廉价的珍稀药物;另一方向是利用转基因动物培养人体器官,     

牙鲆迟钝爱德华氏菌的分离及其鉴定

从患腹水病牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化鉴定方法对该菌进行了鉴定;根据GenBank上报道的迟钝爱德华氏菌标准株(ATCC15947)的16S rDNA序列以及致病性迟钝爱德华氏菌所含有的菌毛亚基(Fi mA)基因(AB100170)的核苷酸序列设计了2对引物,对所分离到的6株疑似菌进行PCR扩增,均能够扩增出目的条带,基因片段大小分别为1 399,540 bp.序列分析表明,扩增得到的基因与其参考菌株序列高度同源,同源性分别为98.86%,100%.分子生物学鉴定结果与常规细菌鉴定方法所得结果一致,证明该菌为迟钝爱德华氏菌.将该菌肌肉注射鲫鱼,发病症状与自然死亡的症状相似,并从患病鲫鱼体内分离到该菌,说明所分离的迟钝爱德华氏菌是患病牙鲆的原发病原菌.     

藤黄微球菌rpf基因的克隆表达及其结构预测

为了了解藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)的性质,用自行设计的引物,以藤黄微球菌ACCC41016基因组DNA为模板,扩增rpf基因.随后,构建pET-28a(+)-rpf表达载体,在Escherichia coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并以克隆测得的rpf基因核酸序列为基础,对Rpf蛋白的氨基酸序列、疏水性、信号肽、磷酸化位点、三级结构以及结构功能域进行生物信息学预测分析.结果表明:该rpf基因与文献报道的藤黄微球菌IAM 14879 rpf基因核苷酸序列一致性为69.72%;该rpf基因所编码蛋白的氨基酸序列与文献报道的Rpf蛋白氨基酸序列一致性为63.44%.在E.coli BL21(DE3)中成功表达了Rpf目的蛋白.初步了解了Rpf蛋白的理化性质及生物学功能.解释了Rpf蛋白能够使细菌复苏并促进其生长的理论,为进一步探讨Rpf蛋白的作用机理奠定了基础.     

山羊FGF5基因cDNA分子克隆及序列分析

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,首次从山羊脑组织总RNA中扩增出成纤维细胞生长因子5(FGF 5)基因的cDNA编码序列.通过对序列的分析表明,克隆的山羊FGF 5cDNA编码序列与其他动物的序列具有高度的同源性.与G enbank中人和小鼠序列比较,山羊与人和小鼠的FGF 5核苷酸序列的同源性分别为91%和87%.编码的氨基酸序列比较,山羊和人的相似性为87%,山羊与小鼠的相似性为83%.如FGF s家族的其他成员一样,山羊的FGF 5蛋白也有一信号肽序列.山羊FGF 5基因外显子在编码氨基酸时,对同义密码子的使用表现有强烈的偏好性.不同物种对同义密码子使用的偏倚程度与偏好类型各不相同,也具有种属特异性.山羊FGF 5基因所编码的蛋白质中,20种氨基酸的含量差异很大,极性氨基酸含量高于非极性氨基酸含量.     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

真核生物中支架蛋白家族(IQGAP family)的分子进化分析

支架蛋白家族(IQGAP family)广泛存在于真核生物中,在细胞的信号转导、骨架运动、细胞分裂的过程中都有着重要功能.研究分析IQGAP蛋白家族的分子进化,有助于深入全面地了解整个IQGAP蛋白家族在不同物种中功能.通过使用相关数据库,在35个真核生物物种中检索到了70个支架蛋白家族成员的序列信息,并对其进行了系统的分子进化研究.我们发现:支架蛋白家族基因广泛存在于后生动物(Metazoan)、真菌(Fungi)、变形虫界(Amoebozoa)以及其他一些真核生物中,提示支架蛋白存在于最后的真核生物的共同祖先(Last Eukaryotic Common Ancestor,LECA).系统发育分析表明脊椎动物的IQGAP蛋白和非脊椎动物中代表性IQGAP基因共享一个共同的祖先基因,单个的IQGAP祖先基因在早期脊椎动物中(在四足总纲和硬骨鱼纲的分离之前),发生了两次基因复制事件,导致现存的脊椎动物中3组IQGAP基因(IQGAP1,IQGAP2,IQGAP3)产生.     

引起人非典型性肺炎的冠状病毒基因组与其它冠状病毒基因组的初步比较

一种在世界范围内突然爆发的致命流行病——急性呼吸窘迫综合症(SARS)击倒了数干人，一种全新的冠状病毒被认为是其病原．5个SARS相关冠状病毒的全基因组序列已经完成．我们进行了SARS相关冠状病毒和其它冠状病毒的基因组进化分析和序列比较，结果显示：1．SARS相关冠状病毒不直接来自于任何已知的冠状病毒；2．E蛋白的基因可能是在近期从其它病毒横向转移到SARS病毒中来的；3．Sl和S2基因发生了较大范围的缺失或插入突变．这些基因横向转移和突变改变了SARS相关病毒的表面结构和抗原性，极有可能是导致其获得侵染人类细胞的主要原因．     

泛素和PR1a信号肽融合基因植物表达载体的构建

泛素（Ubiquitin）融合蛋白策略在近年来已被应用于在植物中提高外源蛋白的产量。信号肽（Signal Peptide）使外源蛋白定向运输到细胞内的特定部位。本研究是在植物高效表达载体pBin438的基础上,采用三引物PCR法（TP-PCR）技术,将拟南芥（Ambidopsis）泛素基因与烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽序列体外重组;并将重组的融合基因定向克隆到植物表达载体pBLG中,获得了含有泛素和PR1a信号肽序列的植物表达载体pBLG-UP。这为进一步验证外源基因在植物体内的高效表达奠定了基础。     

橡胶树糖代谢调控基因HbF2KP的克隆及表达

根据拟南芥、蓖麻及杨树果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶基因(F2KP)的核苷酸序列,使用橡胶树胶乳转录组数据库拼接到1条1 228 bp的核苷酸序列,通过两次RACE-PCR获得了橡胶树长2 629 bp的 F2KP基因cDNA序列,命名为HbF2KP。ORF Finder软件分析结果显示,该序列含有211 bp 的5’端非编码区,173 bp的3’端非编码区,以及长度为2 244 bp的开放阅读框(ORF)。氨基酸同源性分析发现,该蛋白含有保守的激酶和酯酶结构域,属于具有双功能的果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶。生物信息学分析显示,HbF2KP蛋白无导肽酶切位点,不具有跨膜结构域且属于亲水蛋白,推测该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,HbF2KP基因在光合组织及非光合组织中均有表达。对非光合库组织胶乳(产胶细胞的细胞质)中的表达模式进行分析,结果显示该基因表达受割胶、伤害处理及死皮胁迫调控,推测其在橡胶树胶乳糖代谢中发挥重要的调控作用,参与橡胶烃的生物合成调控及死皮胁迫应答。此外,HbF2KP表达受部分植物激素或激素类似物如乙烯利(ET)、植物生长素(2,4-D)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)及赤霉素(GA)的调控,但调控作用不明显。     

大腹圆蛛拖丝蛋白基因3'端克隆和序列分析

用PCR(Polymerase Chain Reaction)技术从大腹圆蛛主壶腹腺组织的基因组DNA和RNA中分别扩增获得编码拖丝蛋白基因的3'端基因序列,克隆PCR产物到pDrive载体,经PCR、限制性酶切筛选和序列分析后证明获得了蜘蛛拖丝蛋白基因两个克隆AvDS1和AvRS2.基因序列和氨基酸序列分析表明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋白基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvDS1和AvRS2具有拖丝蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列特有的结构特征,氨基酸序列中存在4个motifs-(A)n(GA)n(GFGX)n以及(GGX)n.AvDS1与基因库中已报道的蜘蛛拖丝蛋 基因序列同源性较低,而AvRS2与已经报道的Nephila clavipes拖丝蛋白基因组分-1的同源性可达91%,推测AvRS2是编码大腹圆蛛拖丝蛋白基因组分-1基因片段.比较这两个克隆的核苷酸序列和氨基酸序列,发现它们之间没有同源性.推测它们是同一基因的不同片段,或是编码大腹圆珠拖丝蛋白的两个基因组分. 明AvD     

科研用动物设施的设计构思

<正> 生物医学研究用动物的价值随着基因转移技术的进展而增加。胚胎微量注射及基因移植技术使得控制遗传性疾病有了极大的可能性。如果考虑到一个成功的基因转移需要花费的时间与精力,那么一只转基因小鼠的价值自然会超过十万美金。这些动物的生活条件应当保持或接近理想的环境。从基本饲料中可获得营养及水     

黑线仓鼠OPN5的部分克隆及生物信息学分析

神经视蛋白(Neuropsin,OPN5)是非视觉成像蛋白的重要成员之一,主要分布于动物的眼睛、脊髓、大脑和睾丸中,是动物感光物质的重要组成成分.文章以黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)为动物材料,利用RT-PCR技术克隆得到黑线仓鼠OPN5基因的cDNA序列1340bp(KY949483).生物信息学分析表明,该序列包括一个完整的开放阅读框架1134bp,部分5'端非翻译区和部分3'端非翻译区;序列G+C含量远高于A+T含量,提示其Tm值较高,热稳定性强;编码377个氨基酸;蛋白质序列组成、跨膜区和疏水性分析、信号肽分析等均表明,OPN5序列包含N端胞外区、跨膜域和C端胞内域,整体疏水性较强,没有信号肽,不属于分泌蛋白,这些特征均与OPN5膜蛋白的属性相符;OPN5包括7个跨膜拓扑结构、一个G蛋白偶联受体家族和一个视黄醛结合位点,第7个跨膜结构的赖氨酸残基与OPN5对紫外光的敏感性有关;同源性对比显示,黑线仓鼠与中国仓鼠(Cricetulus griseus)、金仓鼠(Mesocricetusauratus)、小鼠(Mus musculus)亲缘关系较近,而与灵长类、偶蹄类的物种亲缘关系均较远,这与传统的物种分类相一致,证实所克隆到的序列正确,同时提示OPN5进化的保守性.本研究为探究OPN5视蛋白在动物繁殖调控中的作用奠定了基础,具有重要理论的意义.