鸡溶菌酶和重组大肠杆菌融合蛋白(NADP-GDH)体外分子交联的初步研究

用PCR方法克隆的大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶 (NADP specificglutamatedehydrogenase ,NADP GDH)基因和其突变基因 ,插入表达载体pTrcHisC构建重组蛋白质表达体系 .经过IPTG诱导表达 ,用Talon固定化金属亲和层析树脂纯化出重组的天然和突变NADP GDH ,将它们和溶菌酶 (Lysozyme)通过热诱导去折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验 ,在去折叠反应液中加入还原剂二硫苏糖醇 (DTT)后 ,不但没有分子间二硫键交联形成 ,同时也没有其他分子间共价键 (异肽键 )交联的形成 .另外 ,半胱氨酸残基定点突变后的NADP GDH重组蛋白质 ,无法参与形成分子间二硫键 ,实验证实经过热诱导去折叠后也没有分子间共价键 (异肽键 )交联 .这些结果进一步证明蛋白质分子间二硫键的形成能够促进蛋白质其他分子间共价键 (异肽键 )的形成 .     

人肽基脯氨酰顺反异构酶基因的克隆、表达、纯化及热变性交联

蛋白质分子间交联是普遍存在的现象．然而，蛋白质交联的分子机理还不太清楚．为了进一步探测蛋白质交联的分子机理，以及交联能否在异源肽链间发生，本实验室克隆了人肽基脯氨酰顺反异构酶(human Peptidylproly-Cis-trans-isomerase，hPPI)cyclophilin cDNA基因，并纯化出了PPI蛋白．最后，将PPI和．lysozyme蛋白进行热变性交联实验，结果显示在同源和异源肽链间都有二聚体和多聚体形成．并证实蛋白质交联可经三步完成：1)蛋白质构象包括二级结构改变；2)形成分子间二硫键；3)形成分子间异肽键．     

绿豆防御素基因的克隆、序列分析和植物表达载体的构建

从绿豆叶片提取总DNA中,通过PCR方法扩增出362bp的具有多种抗病、抗虫特性的绿豆防御素基因, 并将其克隆到pGM-T easy vector,酶切图谱及DNA 测序分析表明克隆的片段包含了完整的绿豆防御素基因的编码序列,与原序列同源性达到99.5%,蛋白质同源性达到100%.此基因编码的多肽由73个氨基酸组成,含有28个氨基酸的信号肽和8个半胱氨酸,可形成4个二硫键.我们用此基因构建了高效植物表达载体pBin438-LD.     

Purification and Partial Characterization of a Collagenolytic Enzyme Produced by Pseudomonas aeraginosa SCU Screened from Rotten Hides

Strain Pseudomonas Aeraginosa SCU isolated from rotten hides is shown to produce various gelatinolytic enzymes with molecular masses ranging from - 50 to - 200 kD. A gelatinolytic enzyme called PAC exhibiting collagenolytic activity is purified by SP sepharose fast flow, Sephadex G-200 gel filtration and native PAGE cutting method. The purified enzyme has an apparent molecular weight of about 110 kD by SDS PAGE without β-mercaptoethanol. Treatment withtβ-Me suggests that PAC is dissociated into three subunits approximately 33 kD, 25 kD and 20 kD with a ratio of 2:1:1, named sub A, sub B and sub C repectively. EDFA and EGTA display a significant inhibitory effect on the enzyme activity while PMSF, leupeptin and pepstain do not appreciably inhibit it. The first 15 amino acid residues of the major subunit (subA) are determined and the sequence is Ala-Glu-Ala-Gly-Gly-Pro-Gly-Gly-Asn-Gln-Lys-Ile-Gly -Lys-Tyr. This sequence is identical to that of elastase of P. aeruginosa. The fragment of encoding mature sub A is cloned and its sequence is determined, which has a high homology with the gene of elastase. These results indicate that PAC is a novel collagenolytic metalloprotease composed of three kinds of subunits, of which elastase is the major one.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糖基转移酶基因的克隆、序列分析及表达

为获得具有催化活性的糖基转移酶纯酶,本研究以短小芽孢杆菌基因组DNA为模板,利用简并PCR技术扩增到基因(GT-A)全长序列.该序列全长1 287bp、编码423个氨基酸,分子量约为49.2KD.经序列分析,该基因属于糖基转移酶基因.根据GT-A基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达重组质粒GTA-pet28a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个约50kD的融合蛋白.纯化后测定其糖基转移酶活性,与37℃相比,80℃的反应温度其活性能提高3.4倍左右.研究结果表明,该酶是一种具有应用潜力的嗜高温糖基转移酶.     

二硫键影响GH11木聚糖酶稳定性研究进展

低聚木糖具有改善肠道微生态的益生作用,在降血糖、降血压、防止便秘等方面表现出良好的保健效果。近年来,利用生物酶技术制备功能性低聚木糖的相关研究受到广泛关注。糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH)11家族木聚糖酶具有底物特异性强和催化效率高的特点,在低聚木糖生产应用中表现出显著优势；然而,大多数天然GH11木聚糖酶存在稳定性较差的问题,无法满足工业生产中高温、酸、碱等极端条件的要求。利用酶工程技术对天然木聚糖酶进行分子改造,以适应高温、酸、碱等生产条件,使底物特异性强、催化效率高的酶相对稳定地发挥作用,对于制备功能性低聚木糖的工业生产具有重要的实际意义。根据GH11木聚糖酶的分子结构及其特点,通过比较其分子内相互作用力对酶热稳定性的影响,发现二硫键在改善酶的稳定性方面具有十分显著的优势。基于对GH11木聚糖酶结构的分析,总结了引入二硫键的常规策略,比较了酶在不同区域引入不同数量二硫键对GH11木聚糖酶稳定性的改善效果,对引入二硫键后酶稳定性显著变化的几个区域进行定位,并指出多个二硫键对改善酶稳定性的作用方式,希望为提高酶稳定性的酶分子改造研究提供基础数据,为拓宽GH11木聚糖酶工业应用范围提供科学参考。     

At3g13600截短型蛋白的原核表达载体的构建

拟南芥基因At3g13600编码一种钙调素结合蛋白,序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 818 bp,编码一个具有606个氨基酸残基的多肽,推测分子量为68.9 kD;在At3g13600蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特性,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)扩增含...     

一个烟草Mlo基因的电子克隆及其序列特性分析

电子克隆并探讨了一个烟草Mlo基因的结构和功能．以GenBank公布的水稻Mlo基因序列为信息探针对烟草的EST数据库进行同源搜索,并将获得的同源性高的EST序列进行序列拼接,最后得到了一个烟草Mlo基因的cDNA序列．采用生物信息学方法分析该基因编码蛋白的一级、二级结构,并对其功能进行预测．结果表明,此烟草Mlo基因...     

Expression and inhibitory activity analysis of a 25-kD Bowman-Birk protease inhibitor in rice

Bowman-Birk protease inhibitors (BBI), belonging to serine protease inhibitors, are well-studied storage and defense proteins widely existing in both dicoty- ledonous and monocotyledonous plants[1―3]. In dicoty- ledonous plants, the BBIs are about 8-kD p…     

Structural biology: analysis of protein-folding cooperativity

The folding of small proteins has been assumed to be an all-or-none process that involves high cooperativity within the structure and substantial kinetic-energy barriers. Sadqi et al. claim that the small re-engineered protein Naf-BBL unfolds without significant cooperativity or kinetic hindrance, a conclusion that is based on calculation of a broad distribution of midpoint thermal-transition temperatures measured by the nuclear magnetic resonance (NMR) chemical shifts of 158 protons. We find that all of the unprocessed melting curves can be fitted to the same two-state global unfolding when uncertainties in the experimental data are taken into account. We conclude that the authors' melting data for Naf-BBL remain consistent with the all-or-none process.     

液晶含氯聚芳酯的热分析

本文采用热重法(TG)和差示扫描量热法(DSC)研究了不同结构含氯聚芳酯的热性能和液晶性.实验结果表明:含氯聚芳酯有良好的热稳定性和理想的液晶性,其中含柔性链段系列含氯聚芳酯熔融温度最低,液晶相变温度范围宽;萘二酚系列含氯聚芳酯熔融温度高,热稳定性好,但液晶相变温度范围窄.     

赤红球菌甲苯胁迫响应蛋白基因的克隆、生物信息学分析和表达变化研究

从赤红球菌SD3中克隆了一个甲苯胁迫响应蛋白基因tsrp1,该基因长度为417 bp,在GenBank的登录号为MK371001.该基因编码的蛋白质Tsrp1由138个氨基酸残基组成,理论分子量为14.2 kDa,理论等电点为4.82,不稳定系数为18.68,总平均疏水指数为-0.154,属于酸性稳定的亲水蛋白.Tsrp1无信号肽和二硫键、无跨膜区、无保守结构域,存在于细胞质中.在R.ruber SD3中Tsrp1蛋白与R. rhodochrous、R. zopfii、R. pyridinivorans、R. hoagii、M. brevis和C. manganitolerans中的序列相似蛋白的相似性分别为94.93%、71.29%、67.96%、44.58%、42.05% 和35.00%.通过分子对接发现Tsrp1与c-di-GMP存在相互作用.在甲苯和苯酚胁迫下,在赤红球菌SD3中tsrp1基因的表达分别为原来的40.19倍和14.73倍.     

(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.     

具有聚集诱导发光性能的四苯乙烯酰胺衍生物的合成与性能研究

文章将四苯乙烯基与己氧基苯通过酰胺键连接起来,合成了四苯乙烯酰胺衍生物。主要利用紫外-可见吸收光谱仪、荧光光谱仪、热重分析仪、示差扫描量热仪、扫描电镜、热台偏光显微镜等表征手段对该衍生物的光物理性能、热性能、聚集诱导发光性能和自组装行为进行了研究。研究结果表明,所合成的化合物在紫外光激发下发射强烈的蓝色荧光;其热失重温度达到359℃,显示出较高的热稳定性;化合物样品在熔融和冷却过程中均能观察到明显的液晶织构,说明其具有明显的液晶性;化合物分子在不同的溶剂组成中可自组装形成棒状或球状形貌不同的聚集体结构。     

聚酰胺6-聚乙二醇共聚物的合成与性能

采用阴离子聚合法合成了一系列聚酰胺6–聚乙二醇(PA6-PEG)嵌段共聚物,对己内酰胺/PEG投料比对共聚物热性能的影响进行重点研究,并分析此方法所得产物的结晶性能.通过傅里叶变换红外光谱、差示扫描量热仪、XRD等测试对产物结构、热性能及结晶性能进行了分析.研究结果表明:嵌段共聚物以酯基相连;PEG质量分数低于20%时,熔点呈规律性下降;高于20%时,共聚物的熔点波动性较大,己内酰胺/PEG的投料比不能决定共聚产物的熔点;己内酰胺/PEG配比相同时,PEG相对分子质量越低,共聚物的熔点也越低;通过阴离子聚合法更容易得到热力学非稳态的γ晶型产物.     

大豆和花生根瘤菌氢酶的研究

根瘤菌在共生固氮过程中因放H2所消耗的能量约占固所氮总能量的40%-6%。吸氢酶则能回收和利用固氮过程所放的H2,养活能量损失,从而提高共生固氮效率。在厌氧条件下,加入防止酶蛋白聚合的试剂,利用DEAE-纤维素和Sephacry S-200柱层析,从自养性大豆根瘤菌和花生根瘤菌类菌体中分离并提纯膜结合态氢酶。纯化的两种氢酶表现相近的分子特征：均含有大（60kD,65kD)、小（30kD,35kD)两个亚基,均为NiFe-氢酶,并且有较高的吸H2活性。大豆根瘤菌氢酶的纯酶组分不含Cyt b599。花生根瘤菌L8-3菌株能进行化能自养生长,诱导出高吸H2活性。根瘤菌的吸H2能明显提高固氮活性。从具有高吸H2活性的花生根瘤菌中分离并克隆吸氢基因,采用PCR和探针杂交技术,获得含有吸氢基因的质粒pZ-55。利用多种限制性内切酶构建了质粒pZ-55的物理图谱。通过三亲本杂交,将含吸氢基因的重组质粒转移到不吸H2的花生和毛豆根瘤菌中,所获得的结合株在自生和共生条件下均表达吸H2活性。以结合株接种大田花生,获得的共生根瘤的吸H2活性比接种受体株提高4倍,花生叶片和种子的含N量、产量分别提高1.7%、8.9%和9.6%。     

P2O5-SiO2-Na2O-Al2O3玻璃系统的热力学性质

采用差式扫描量热法(DSC)和热机械分析(TMA)方法研究了P2O5-SiO2-Na2O-Al2O3玻璃系统的热力学性质,探讨了磷酸盐玻璃中不同二氧化硅含量对其特征温度、热膨胀系数的影响、研究表明,随着SiO2的增加,玻璃转变温度Tg及玻璃软化温度Tf逐渐升高,热膨胀系数逐渐降低。     

纳米Co_2TiO_4的热稳定性

藉助于Ｘ－射线衍射（ＸＲＤ）谱和热重（ＴＧ）分析，研究了纳米Ｃｏ２ＴｉＯ４的热稳定性。结果表明在第一次升温测量的差示扫描量热（ＤＳＣ）曲线上存在两个吸热峰（Ｐ１，Ｐ２峰）和一个放热峰（Ｐ３峰），再次升温测量时，这些峰均消失了。研究表明，这些峰分别起因于物理脱附、化学脱附、相变和晶粒长大。     

高熔体强度聚丙烯的制备及其性能研究

聚丙烯（PP）因其优良性能广泛应用于诸多领域,但同时也有着韧性差,熔体强度低等缺点。而高熔体强度聚丙烯（HMSPP）是一种具有较高熔体强度、较好熔体弹性的聚丙烯树脂,它的发现拓展了聚丙烯在物理发泡、挤出涂布及热成型等领域的应用,多年来一直是聚烯烃研究工作的重点。本文以2,5-二甲基-2,5-双-（叔丁基过氧）己烷（DHBP）为引发剂,采用多官能团单体三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）对市售聚丙烯（PP）进行接枝,同时加入支化促进剂二硫化四丁基秋兰姆（TBTDS）以提高接枝效率,成功制备了具有高熔体强度的聚丙烯并进行了配方优化。本文测定了接枝产物的熔体流动速率(MFR)及采用公式法计算熔体强度(MS)。通过红外光谱（IR）对所得高熔体强度聚丙烯的分子结构进行表征,结果表明单体已接枝在PP主链上,通过差示扫描量热法（DSC）、热重分析（TG）方法,对所得高熔体强度聚丙烯的热性能进行分析和表征,结果表明接枝产物的熔融温度没有显著变化,耐热温度有所上升。拉伸强度、弯曲强度、冲击强度等力学性能的测定结果表明接枝产物的力学性能有显著提高。