拟南芥过氧化氢酶敲除载体构建

过氧化氢酶(CAT)是一种重要的H_2O_2清除酶,广泛地存在于有氧生物细胞体内,并且对于维持体内氧化水平至关重要。因此,获得完全敲除CAT遗传突变体无疑对于研究H_2O_2调控植物生长和发育提供重要的材料。目前已知拟南芥中有3个CAT基因(CAT1、CAT2、CAT3),其中CAT1和CAT3两个基因之间的连锁遗传,很难获得使CAT完全缺失突变体(cat1 cat2 cat3)。文章利用CRISPR/Cas9技术构建多靶点双元载体以期同时敲除CAT1、CAT3基因,并转入cat2突变体中,以期获得cat1 cat2 cat3三突变体。CAT完全缺失突变体的获得为研究过氧化氢酶功能及H_2O_2信号转导机制提供必要的遗传材料。     

拟南芥PIN2介导的生长素极性运输调控植物根向地性

主要观察了拟南芥生长素输出载体PIN2及其介导的极性运输、生长素诱导合成对根尖生长素不对称分布和根向地性反应的影响.结果表明:拟南芥PIN2基因突变、诱导内源生长素IAA及用抑制剂NPA或TIBA抑制生长素极性运输都严重影响了根尖生长素不对称分布的形成,最终抑制植物根向地性反应,暗示PIN2介导的生长素极性运输和生长素不对称分布在根向地性反应中起着关键性调控作用.从这些研究结果可进一步理解生长素调控植物根向地性的分子机理.     

F-box基因FOF2在拟南芥盐和冷胁迫响应中的功能分析

FOF2为F-box蛋白家族成员,其生物学功能尚不清楚.采用实时荧光定量PCR和生理学实验相结合的方法,对FOF2基因的表达模式及其在拟南芥抗盐和冷胁迫响应中的作用进行了分析.研究发现,FOF2在拟南芥根、茎生叶和果荚中表达较高,并且其表达受盐和冷胁迫诱导.FOF2过表达株系对盐胁迫敏感,与野生型相比种子萌发率低、幼苗主根较短;相反,fof2突变体对盐胁迫的敏感性则减弱.FOF2过表达和缺失突变体种子萌发对冷胁迫无响应,但其主根在冷处理中分别比野生型短或者长.盐处理下,FOF2过表达株系中盐胁迫反应相关基因的表达量显著降低,fof2突变体中则升高;冷处理下,FOF2过表达株系中冷胁迫反应相关基因的表达量显著升高,fof2突变体中则降低.结果表明,FOF2在植物抗盐胁迫响应中起负调控作用,在抗冷胁迫响应中则可能起正调控作用.     

水稻盐敏感突变体ssm1的生理指标分析

探索水稻对盐胁迫的耐受机制,培育高产耐盐水稻是提高盐碱土地利用率的重要手段.通过对甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的种库进行耐盐筛选获得了盐敏感突变体ssm1,该突变体同时具有叶片早衰表型.进一步研究发现,盐处理后突变体中H_2O_2和MDA含量显著高于野生型,总抗氧化能力显著低于野生型.此外,盐胁迫处理6 h后耐盐相关基因MYB2和HKT1.1表达量下调.推测ssm1突变体的盐敏感表型是由于突变体中H_2O_2和MDA的积累导致的膜脂过氧化或膜系统受损,继而造成大量外源Na~+进入细胞导致细胞死亡.通过对盐敏感突变体ssm1的生理指标分析,探究SSM1参与水稻盐胁迫耐受机制,为培育高产耐盐水稻品种提供重要理论依据.     

植物叶片H_2O_2胁迫应答蛋白质组学分析

植物叶片是感知外界H_2O_2胁迫信号的重要器官.整合分析了水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和柑橘(Citrus aurantium)在应对不同程度H_2O_2胁迫时蛋白质表达模式的变化特征.阐明了H_2O_2胁迫应答网络体系中的信号与代谢通路(如:光合作用、糖类与能量代谢、转录调控、蛋白质合成与命运、胁迫防御、信号转导和基础代谢等)的变化及植物叶片应答H_2O_2胁迫的分子调控机制.     

细胞自噬在植物应答盐胁迫中的作用研究

本研究以模式植物拟南芥为材料,利用生理学和遗传学手段分析了盐胁迫下细胞自噬基因和活性氧(ROS)变化的相关性.结果表明野生型拟南芥Col-0在遭受盐胁迫处理3d表现了叶片漂白的症状并且会诱导ROS的产生和积累了大量的细胞死亡.荧光定量PCR实验表明盐胁迫会诱导细胞自噬相关基因的表达,细胞自噬参与了调控植物的防御机制来响应盐胁迫.进一步的实验表明拟南芥细胞自噬突变体atg2和atg5在遭受盐胁迫处理3d表现了更加严重的叶片漂白症状并且积累大量的细胞死亡和ROS.初步表明细胞自噬主要是通过调控ROS的产生来应答盐胁迫.     

拟南芥抗盐单基因突变体的诱导与筛选

用Co60-γ射线辐照野生型拟南芥种子，将诱变处理后的M一代种子温室种植，收获的M2代种子用于抗盐突变体的筛选，将在200mmol／L盐胁迫条件下筛选出的352株幼苗根仍表现向地性生长或真叶不变为褐色的植株作为可能的突变体，再将这些M2代可能的突变体移苗种植至基质中并收获M3代种子，经对M3代的抗盐性状继续进行检测，最终获得4株100％表现抗盐性状的突变体。     

拟南芥AtHHR2基因的功能初步研究

为了研究拟南芥Highly Homologous RING domain 2基因(At5g43200)在盐胁迫逆境的功能,通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T-DNA插入突变体athhr2,并通过根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得了athhr2/ATHHR2互补转基因株系.对突变体、互补转基因株系及野生型进行盐胁迫处理,对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测,发现盐处理后缺失突变体的萌发率降低,脯氨酸和叶绿素含量低于野生型,互补株系的萌发率、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型.以上结果证明AtHHR2基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控作用.     

拟南芥ein2-1突变体对盐胁迫的响应

以拟南芥突变体ein2-1为材料,研究了其抗逆特性.基于发芽和根生长分析,发现拟南芥突变体ein2-1对盐胁迫高度敏感,此外,拟南芥ein2-1突变体对渗透胁迫和脱落酸也表现为高度敏感;结果表明EIN2基因参与了盐胁迫响应的调节.     

盐和过氧化氢胁迫下交替氧化酶调节根生长和细胞死亡

用不同浓度的NaCl或外源过氧化氢(H_2O_2)溶液处理野生型(WT)拟南芥和交替氧化酶(alternative oxidase,AOX)基因反义抑制突变体(AS-12)拟南芥,发现随NaCl和过氧化氢浓度的增加,两种拟南芥幼根生长速率降低,且出现了明显的细胞死亡。在50和100 mM NaCl或在50 mM H_2O_2处理下,与WT植株相比,AS-12植株幼根的生长速率更低,且组织的细胞死亡程度也更加明显。150 mM NaCl或100及200 mM H_2O_2处理导致AS-12与WT幼根的生长停止和严重的细胞死亡,但两种植株幼根在生长速率和细胞死亡程度上无明显差别。以上实验结果说明交替氧化酶在一定水平的盐胁迫和氧化压力下能够影响幼根的生长和细胞死亡的发生。     

拟南芥AtHHR3响应热胁迫应答的初步分析

拟南芥基因AtHHR3编码一个RING结构域的E3连接酶,通过生物信息学分析发现其可能参与植物热胁迫相关的应答.为了探索其具体的功能,构建了AtHHR3互补株系,并在DNA水平和转录水平分别鉴定了AtHHR3互补株系,用RT-PCR技术分析了AtHHR3在热处理条件下基因表达的变化情况.在热胁迫下分析了野生型、突变体athhr3、回复株系幼苗存活以及种子萌发的表型变化情况,发现突变体athhr3表现出对热胁迫的耐受性,并检测了热胁迫下不同株系的HSF、HSP等热相关基因的转录水平的变化,初步的研究表明拟南芥基因AtHHR3负调控植物对热胁迫的耐受性.     

盐胁迫对拟南芥Profilins和ADFs转录水平的影响

盐胁迫是影响植物生长发育的重要影响因子,是造成农业减产的重要因素之一。因此抗盐基因的功能研究具有重要的理论意义和应用价值。以往的研究表明,肌动蛋白细胞骨架在植物对盐胁迫的响应中起着重要作用,但肌动蛋白结合蛋白在盐胁迫中的作用尚不清楚。文章以拟南芥为试验材料,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术探讨profilins和ADFS基因在盐胁迫处理下的表达。结果表明,用150mmol/L NaCl处理2周野生型拟南芥幼苗时profilins和ADFs基因的表达量明显升高,说明profilins和ADFs基因可能受到NaCl诱导。该实验结果为进一步研究该基因调控植物抗盐的机制提供了基础。     

2013-27 科技要闻

植物生长素空间分布和器官形态新发现作为植物发育调控最重要的激素,生长素的含量及其在器官中的分布(空间分布)决定了植物器官的形态建成、株型以及向重性反应等生物学进程。然而,目前对植物生长素在器官中空间分布的调控机制仍缺乏了解。中国科学院植物研究所胡玉欣研究组以拟南芥为材料,通过研究功能获得及缺陷突变体,发现植物特有转录因子IDD14、IDD15和IDD16协     

NAC1启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NAC1上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NAC1启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达.进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导.初步说明NAC1基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因.     

镉胁迫对Fibrillins突变体的生理影响

以拟南芥Columbia(Col.)生态型和Fibrillins突变体(fib8和fib1a)为研究对象,对镉胁迫条件下植株的萌发、根长生长以及植物体内H2O2和MDA含量及CAT活性的变化进行了测定.本研究发现,30μmol/L Cd2+浓度胁迫条件下,Col、fib8和fib1a的萌发未受到抑制,但根长生长都受到了抑制,fib8和fib1a的抑制程度比Col更为明显,表明突变体比野生型对镉胁迫更敏感.进一步测定镉胁迫前后Col、fib8和fib1a体内的H2O2和MDA含量及CAT活性的变化,结果显示Col、fib8和fib1a体内的H2O2含量增加量分别为处理前的1倍、10倍、8倍,Col、fib8和fib1a体内的MDA含量增加量分别为处理之前的2倍、14倍、12倍,Col、fib8和fib1a体内的CAT活性下降程度相似约为20%.由实验结果推测Fibrillins可能通过影响植物体内H2O2和MDA含量的变化参与植物响应重金属镉胁迫.     

AtVDAC2参与拟南芥盐胁迫信号应答过程

为了探索VDAC在盐胁迫信号传递途径中可能的传递关系,以AtVDAC2转基因拟南芥过量表达和抑制表达株系为材料,初步探索盐胁迫过程中该基因参与信号传递的方式.实验分析了NaCl处理对种子萌发的影响、Ca²⁺对NaCl胁迫下种子萌发的影响,以及NaCl对气孔运动的影响和盐胁迫相关基因的表达水平.实验结果指出,AtVDAC2基因表达水平变化影响了拟南芥对NaCl的敏感性:高表达的AtVDAC2使得拟南芥种子对NaCl敏感性提高,种子萌发率降低,气孔关闭较快;而低表达的AtVDAC2使得拟南芥对NaCl敏感性降低,种子萌发率高,气孔不易关闭.在NaCl胁迫下添加Ca²⁺,提高了敏感株系种子的萌发率,因而推测Ca²⁺帮助AtVDAC2转基因拟南芥过量表达株系平衡下游的胁迫应答.用实时荧光定量PCR检测盐胁迫应答相关基因SOS1,SOS2的表达水平,发现AtVDAC2的高表达引起了下游应答基因SOS1,SOS2表达水平的相应提高;相反AtVDAC2的抑制表达则导致SOS1,SOS2表达水平下降.由此说明,AtVDAC2参与了拟南芥盐胁迫应答过程.     

盐胁迫下盐芥和拟南芥内源激素质量分数变化的研究

采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定了盐胁迫下盐芥(Thellungiella halophila)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片中生长素(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(ZR)和脱落酸(ABA)等4种内源激素的质量分数,分析了2种植物的4种内源激素在盐胁迫下的响应特征.结果表明:48 h盐胁迫下拟南芥中的ABA质量分数增加2～2.7倍,是主要的胁迫响应激素;盐芥中呈积累增加的是IAA、ZR、GA,皆为促进生长的激素.说明盐胁迫下2种植物的激素应答方式不同.     

拟南芥RING finger结构域AtHHR1基因的功能初步研究

为了研究拟南芥基因AtHHR1(编码一个含有RING finger结构域的E3连接酶)是否参与热胁迫响应,构建了athhr1/AtHHR1互补转基因株系.对突变体、互补株系及野生型进行热胁迫处理,发现突变体的萌发率、叶绿素及脯氨酸含量高于野生型,而互补株系均低于野生型.通过real-time PCR定量检测发现,热诱导后拟南芥热信号通路中相关热激蛋白基因在突变体中表达比野生型中高.研究结果初步表明AtHHR1基因在拟南芥的热胁迫响应中起负调控作用.     

NACl启动子驱动GFP表达的组织特征及对生长素和赤霉素的反应

将拟南芥中转录因子基因NACl上游调控区1kb克隆到pRD420质粒，构建由NACl启动子驱动绿色荧光蛋白基因（GFP）表达的植物表达载体，并以此载体转化烟草，对阳性转基因植株研究表明，GFP在根部有较高水平的表达．进一步用生长素、生长素拮抗剂NPA和赤霉素处理，荧光强度的变化表明：该调控区受生长素作用的同时也受赤霉素诱导．初步说明NACl基因不仅是一个生长素反应基因，同时可能也是一个赤霉素反应基因．     

拟南芥抗盐突变体的筛选

盐胁迫是影响植物生长发育的非生物胁迫因素之一,目前发现的盐胁迫信号途径的基因还非常有限.发掘新的耐盐相关基因对于了解植物的盐胁迫响应机制和改善作物的耐盐性具有非常重要的意义.从EMS突变体库中筛选突变体是一种经典的正向遗传学方法,有可能筛选到从T-DNA插入突变体库中无法发现的新基因.本实验用160mmol/L NaCl作为盐胁迫的筛选条件,以在含盐平板上长出绿色子叶作为筛选指标筛选抗盐(Salt Resistant,ST)的EMS突变体,初步筛选到了140株ST突变体,其中84株收到了种子,第二代进行抗盐表型确定后,得到了15株表型稳定的ST突变体,均表现出明显的抗盐表型,并对其中的一些突变体做了初步的表型及基因定位分析.