应用于PCR技术的DNA聚合酶

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应（PCR）的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。     

植物高度同源重复基因的PCR检测

以油菜中三个同源性高达90%以上的AP3基因为研究对象,采用三种不同的DNA聚合酶进行常规PCR扩增和纳米PCR扩增.结果显示：纳米PCR比普通Taq DNA聚合酶和低保真Plus DNA聚合酶具有更高的扩增特异性,即在相同的退火温度下,只有纳米粒子PCR扩增出特异性的目的产物而无非特异性产物; 虽然高保真Pfu DNA聚合酶PCR显示出了同纳米PCR一样的扩增特异性,但纳米PCR不仅能表现出较高的扩增特异性,而且还显示出了更好的扩增效率.并且,纳米PCR即使是在30 ℃的低退火温度下依旧能扩增出特异性     

RAPD-PCR技术及其在昆虫学研究中的应用综述

聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction,简称 PCR)技术是一项可在生物体外对特定 DNA序列进行快速扩增的新技术。随机扩增的多态性 DNA技术 (Random amplified polymorphic DNA,简称 RAPD)是一项基于 PCR技术上的 DNA分子水平上的大分子多态检测技术。本文对该技术在昆虫学研究领域的应用状况做了一个系统的收集和整理 ,认为它在昆虫分类、系统进化、抗药性机理及抗性基因检测等方面的研究中具有着广泛的应用前景 ,而且它的应用前景随着技术和统计方法的完善将更加广阔。     

DNA检测方法在鱼类物种鉴定中的应用

总结了近年来在鱼类物种鉴定中常用的DNA序列分析、DNA指纹技术、物种特异性聚合酶链式反应和实时荧光PCR技术等DNA检测方法,同时对各类方法的特点和局限性进行了分析．     

聚合酶链反应检测石蜡切片中金黄色葡萄球菌DNA的研究

目的　探讨聚合酶链反应技术 (PCR)在检测石蜡包埋组织中金黄色葡萄球菌DNA的应用及价值。方法　利用PCR技术 ,对 55例福尔马林固定、石蜡包埋小鼠组织中SA DNA进行了检测。结果　 55例石蜡包埋的小鼠组织中均检测到SA DNA ,这与临床病理诊断为金黄色葡萄球菌 (S .aureus)感染相一致。结论　PCR技术可用于检测石蜡包埋组织中的SA DNA片段 ,为鼠S .aureus感染的回顾性分析提供了有效手段     

重组Tth DNA聚合酶基因的克隆表达及活性鉴定

Tth DNA聚合酶具有聚合酶与反转录酶两种功能,而且耐高温,但是国内并未实现高效生产.本研究以粗提的嗜热栖热菌Thermus thermophilus基因组为模板,采用PCR分段扩增和酶切连接的方法获得Tth DNA聚合酶基因全长序列;然后构建重组质粒pXT99b/Tth并转化表达菌E.coli DH5α,利用IPTG诱导Tth基因表达,并采用热处理、Ni2+柱纯化融合His-tag的Tth DNA聚合酶,最后利用PCR、RT-PCR鉴定其活性.结果显示,本研究获得Tth DNA聚合酶基因全长2 505bp,成功表达并获得高纯度高活性的重组Tth DNA聚合酶,1L发酵液所得粗酶液中,酶活性约有800 000U,酶的比活约为6 315U/mg.本研究最终实现了Tth DNA聚合酶的高效国产化并降低了实验成本.     

DNA体外扩增技术——聚合酶链式反应(PCR)

PcR(PolymeraseChainReaction)译为聚合酶链式反应,是近年来发展起来的一种DNA体外扩增技术．具有快速,简便和特异性强的优点,在分子生物学研究方面的应用具有广阔的前景．本文简要介绍了PCR技术的原理,影响因素及其应用．     

Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达及快速纯化

来源于Pyrococcus furiosus COM1菌的Pfu DNA聚合酶具有保真性高、延伸速度快、热稳定性强等特点,能够提高PCR反应过程中的扩增效率,减少错误碱基掺入率.以大肠杆菌Rosetta(DE3)为重组细胞,利用一种快速表达纯化方法,让Pfu DNA聚合酶的表达纯化过程变得更加简便,并维持其高活性.结果表明,Pfu DNA聚合酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)中能够进行大量表达,同时60℃高温水浴能有效去除杂蛋白,简化纯化步骤及提高Pfu DNA聚合酶纯度.经过一系列纯化步骤处理后,Pfu DNA聚合酶仍然能够保持较好的酶活,且在100μL PCR反应体系中,加入4μL的1 mg/mL Pfu DNA聚合酶液效果最佳.     

海桐ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对海桐的遗传多样性进行研究,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如退火温度、Mg2 浓度、4×dNTP浓度、牛血清白蛋白浓度、模板DNA用量、引物用量以及Taq DNA聚合酶用量等指标进行优化,建立了可用于海桐ISSR分析最适宜的反应体系:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L 4×dNTP,2.0 mg/mL牛血清白蛋白,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 U Taq DNA聚合酶.引物UBC807的最适退火温度为50.7℃.     

纳米银颗粒增强聚合酶链式反应长片段DNA反复扩增的特异性

基因操作者经常需要把数量稀少的DNA样品进行反复扩增以供进一步研究之用.在反复扩增过程中,上一次扩增产物当作下一次扩增的模板使用.对于较短的DNA片段(几百个碱基),一般反复扩增不会遇到特别的困难;但是较长DNA片段(几千到几万个碱基)的反复扩增一般会极大地降低聚合酶链式反应(PCR)的特异性.实验中发现,当扩增较长片段基因时,在常规PCR热循环体系中添加粒径平均为70 nm的银颗粒,使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL,可以在一定程度上保持PCR反复扩增反应的特异性.其机理之一可能是常规PCR反应体系在添加了纳米银颗粒后改善了溶液的导热性能.     

高AT含量DNA片段PCR扩增体系的优化

选用4种不同长度(1.0～5.4 kb)、高AT含量(72%～80%)的真菌线粒体DNA片段,通过比较4种PCR添加剂(牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和镁离子)和4种KOD系列DNA聚合酶(KOD-Plus-、KOD-Plus-Neo、KOD FX和KOD FX Neo)对PCR扩增效果的影响,优化高AT含量DNA片段的PCR扩增体系。结果表明:当PCR体系中单独使用1种添加剂时,只有镁离子能够促进扩增,其他3种添加剂都不能产生预期扩增条带。BSA和DMSO对镁离子的扩增促进作用无负面影响,而甲酰胺会抑制镁离子的扩增促进作用。当镁离子存在时,4种KOD聚合酶的PCR体系均可获得预期的扩增产物;当缺乏镁离子时,使用KOD-Plus-或KOD-Plus-Neo聚合酶的PCR体系未能得到扩增产物,表现出对镁离子的依赖性。镁离子对高AT含量DNA片段的扩增具有促进作用,最佳使用浓度为1.75 mmol/L。研究结果为其他真核生物中高AT含量DNA片段的扩增提供了方法依据。     

稀土离子对TaqTMDNA聚合酶的抑制机理

在PCR扩增水平上研究了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制机理,采用动态荧光比色法测定PCR扩增产物浓度，证明了La^ 3和Ce^ 3在10～50μmol／L抑制DNA复制是由于其抑制了Taq^TMDNA聚合酶的活性所致,且该抑制属竞争性的抑制，得到了La^ 3和Ce^ 3对Taq^TMDNA聚合酶的抑制常数分别为12．7μmol／L和14．4μmol／L。     

地毯草ISSR反应体系的建立与优化

在利用ISSR技术对地毯Axonopus compessus(Sw.)Beauv.种质资源的遗传多样性进行研究的实验过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如DNA的提取、模板DNA质量浓度、Taq酶的选择及其用量、Mg2 浓度、dNTP的用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,筛选优化出可用于地毯草ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:10μL PCR反应体积中,10×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,ph9.0,50mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),0.75 U Taq DNA聚合酶(上海申能博彩),0.375 μmol/L引物,180μmol/L dNTP,1.5～2.0 mmol/LMgCl2,10ng模板DNA.     

单壁碳纳米管对长片段聚合酶链式反应(PCR)增效机理的初步研究

为了开发新型基因扩增技术,采用两步PCR(two-step PCR)和rpsL保真度实验等方法,对单壁碳纳米管(single-wall carbon nanotube,SWCNT)在长片段PCR反应中的增效机理进行研究.结果表明:在长片段PCR反应中,单壁碳纳米管最适工作质量浓度为0.8,mg/mL;单壁碳纳米管可以在较短的延伸时间增加扩增产物产量,提高DNA聚合酶的反应效率;通过rpsL保真度实验显示,对照组PCR产物的错误率为5.32×10–6,而实验组的错误率仅为2.39×10–6.     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为:25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2+2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。     

新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增体系的优化

以3个新疆杏品种的叶片为试材,以其叶片基因组DNA为模板,分别对PCR扩增体系中的10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、TaqDNA聚合酶和退火温度5个因素设计6个梯度,研究了新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增条件,建立其优化的PCR扩增体系。研究结果表明:其扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸2min,35个循环后72℃延伸10min,25μL反应体系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP0.08mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA80ng,DNA聚合酶1μL,此为最优的反应体系。     

MTHFR基因C677T点突变的PCR-TGGE检测技术的建立

目的 :建立检测MTHFRC6 77T点突变的PCR -TGGE技术 .方法 :以中国人群外周血基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应扩增该基因外显子 4 ,用温度梯度凝胶电泳 (TGGE)分析检测PCR产物 ,对电泳结果异常者进行DNA测序 .结果 :垂直型TGGE与平行型TGGE均发现该外显子存在杂合性突变 ,经DNA测序证实为C6 77T点突变 .结论 :该技术具有快速、分辨能力高和重复性好的特点 ,是一种有效的检测核酸序列变异和点突变的技术 .     

藜ISSR-PCR反应体系的优化

采用TaKaRa的PCR反应系统,以从藜(Chenopodium album L)幼叶中提取纯化后的总DNA为模板,进行UBC 859号引物的ISSR-PCR扩增实验,分别测试了镁离子、模板DNA和Taq DNA聚合酶含量对反应结果的影响,通过各因子的浓度梯度组合实验,确定了在25 mL体积的PCR反应中:酶配套缓冲液2.5μL,dNTPs0.2μmmol/L,引物0.2 mmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,模板含量为40 ng,Taq DNA聚合酶为1.5 U是藜最佳的ISSR-PCR反应体系。     

不同分子量PVP对PCR扩增反应效率的影响

以人为设计的110bp单链DNA为模板,研究不同分子量聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinyl-pyrrolidone,PVP)对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的影响。实验结果表明:0.5%的PVP K-30、PVP 8000、PVP 58000和PVP 630000均可显著提高PCR效率,并且这4种化合物提高PCR效率的能力,依次为PVP 630000>PVP 58000>PVP K-30和PVP 8000;然而,在相同浓度时,PVP K-40却显著抑制PCR扩增反应;另外,溶解曲线的实验结果显示,0.5%PVP 630000可显著降低PCR产物的Tm值,表明PVP 630000可通过与DNA相互作用,降低DNA结构稳定性,使得模板更易在PCR的变性阶段解链,最终提高PCR效率。上述研究结果表明,不同分子量的PVP对PCR扩增效率的影响不同,与其分子量大小密切相关。     

泡桐属植物cpDNA分子发育PCR反应体系快速建立及优化

为了快速有效地确定泡桐属植物分子发育系统PCR反应体系,将影响PCR扩增体系的主要单因素因子Taq DNA聚合酶、Mg~(2+)、dNTPs替换成Taq PCR Master Mix;通过模板DNA,引物浓度和退火温度对体系进行优化,建立最适合泡桐属植物叶绿体DNA的PCR最适反应体系(25μL):5μL模板DNA,1.0μL引物,12.5μL Taq PCR Master Mix,5.5μL ddH_2O,反应体系具有较高的稳定性和重复性;筛选出了适合泡桐属植物分子系统发育学研究的引物:trb V-ndh C,Agt1F-Agt1R,ITS4-ITS5.