一株主产庆大霉素C2a工程菌的构建

为更好生产单组分庆大霉素C2a,拟构建一株主产庆大霉素C2a的工程菌.通过序列比对分析,锁定genB2为构建该工程菌的关键基因.以绛红小单孢菌G1008基因组为模板,PCR扩增genB2的上下游序列为同源交换臂,构建同源重组质粒pZB303.通过接合转移,将质粒pZB303导入绛红小单孢菌G1008,安普抗性及PCR扩增筛选得到一株genB2框内缺失工程菌GB102.发酵并提取代谢产物,再经TLC,HPLC,MS分析.结果表明,工程菌GB102主要积累庆大霉素C2a.有望用于生产单组分庆大霉素C2a.     

同工异源酶基因forp与genp异源表达的研究

来自绛红色小单孢菌G1008的genp与来自橄榄星小单孢菌FOM808的forp,均参与3’,4’-双脱羟基,2个基因属于同工异源酶基因.应用同源重组原理,实现forp替换genp,探索同工异源酶基因异源表达的可能性.以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建同源重组质粒pFP4.经接合转移将载体导入到G1008基因组中,利用影印筛选和PCR验证的方法,获得基因重组工程菌FTP2.提取工程菌次级代谢产物,经TLC和MS分析.结果表明,工程菌仍然可以产生庆大霉素C组分.forp基因的功能得到了体现,外源基因forp实现了异源表达,进一步证实forp是负责参与3’,4’-双脱羟基的功能基因.     

genP基因在依纽小单孢菌中表达的分析

庆大霉素生物合成过程中的genP基因和西索米星生物合成过程中的sisI基因属同工异源酶基因,均能催化绛红糖胺3′,4′-双脱羟基反应。本研究借助组合生物合成,探索绛红小单孢菌中的genP基因能否在依纽小单孢菌中表达。首先构建genP基因替换sisI基因的同源重组质粒pKPI4,并经接合转移将其导入依纽小单孢菌TS388中,最后再通过影印筛选及PCR鉴定获得genP基因替换sisI基因的工程菌PTI886。将野生型菌株TS388、sisI基因缺失突变株TI1102(TS388△sisI)及工程菌PTI886在同等条件下进行发酵,提取其代谢产物并经薄层层析及质谱分析。结果表明,突变株TI1102不能合成西索米星,而工程菌PTI886仍能继续合成西索米星,且代谢产物组分与野生型菌株TS388相比无明显变化,说明genP基因能在依纽小单孢菌中表达。本研究揭示了同工异源酶基因异源表达的可行性,可为今后不同微生物异源基因组合的研究提供借鉴。     

几种氨基酸对庆大霉素生物合成的影响

在绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)产生庆大霉素的过程中,运用正交设计筛选庆大霉素(gentam icin)生物合成促进剂——氨基酸.经摇瓶实验证明,在原培养基中添加一定量的甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、蛋氨酸,在旋转摇床上220 r/min 36℃培养96 h,有利于生物合成庆大霉素,较对照产量可增加30%左右,产素率提高40%左右.     

庆大霉素生物合成关键酶基因在E.coli中的克隆与表达

从庆大霉素产生菌?棘孢小单孢菌基因组中扩增出参与庆大霉素生物合成的关键酶基因——2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因GntB,将其分别克隆到克隆载体pBS-T和表达载体pET-22b(+)上,并将pET-gntB转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),用IPTG诱导使GntB基因实现表达.GntB基因大小为1 193 bp,其编码的氨基酸含397个残基,约为42 kD的多肽链.     

150株小单孢菌的分类及生物活性

对从承德地区土样中分离出来的150株放线菌进行了初步的分类研究,初步鉴定为小单孢菌属菌株.从中选出100株与3株小单孢菌属(Micromonospora)已知菌株进行生物活性的测定.通过测定发酵液的化学效价,筛选出2株庆大霉素效价高的野生型菌株,其中菌株80221的化学效价为983.58 mg/L,菌株80177的化学效价为1 076.88 mg/L.     

棘孢小单孢菌F-212种子移种期的控制及其对庆大霉素生物合成的影响

本文探讨了庆大霉素生产菌棘孢小单孢茼F-212的一级和二级种子的不同生长阶段的菌丝形态及其控制方法,以作为提高庆大霉素发酵单位的工艺手段。     

庆大霉素高产菌株的抗性方法选育

以生产菌株绛红小单孢菌为出发株,应用N 离子注入及紫外线诱变技术,利用高浓度的庆大霉素梯度平板筛选,或配合含有高浓度庆大霉素的液体培养基的生态驯化,筛选到摇瓶效价分别比出发株提高75.2%和70.1%的N08和Wt63两个高产菌株,10 L发酵罐发酵产量分别达2 118 u/mL和1 843 u/mL,C组分含量符合中国药典2000版的规定.     

提高庆大霉素产生菌F-212孢子萌发率的研究

本文研究了三十一种孢子萌发因子对庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌F—212的孢子萌发率和芽长的影响。分别进行了单因子、双因子及四因子试验,并通过正交试验找出了促进孢子萌发的最适剂量组合,为进一步提高庆大霉素发酵水平创造了条件。     

N-乙酰氨基葡萄糖对绛红小单孢菌合成庆大霉素的影响

研究了N-乙酰氨基葡萄糖对绛红小单孢菌产素的影响,实验探索了N-乙酰氨基葡萄糖添加工艺,在250mL摇瓶发酵过程中培养48h,60h分别添加0.05%,0.15%N-乙酰氨基葡萄糖可使庆大霉素生测效价达2 030U/mL,较对照1 228U/mL提高了65%以上(三次平均基本一致);5L发酵罐试产三批次发酵终结,生测效价平均为1 727U/mL(厡工艺1 097U/mL)提高了57%,效果十分明显.同时测定了发酵过程中菌体代谢各种参数的变化,证明了N-乙酰氨基葡萄糖在绛红小单孢菌生物合成中的促进作用.本方法操作简单,基本不改变原工艺,生产成本低廉,对提高庆大霉素产量效果非常明显.