PDCD5调控的p53动力学分岔分析

肿瘤抑制蛋白p53在DNA损伤的反应中起到关键的作用.基于PDCD5(Programmed Cell Death 5)调控的p53-Mdm2振子模型,增加了药物依托泊苷(etoposide,简称ETS)引起DNA损伤进而激活ATM(ataxia telangiectasia mutated)的模块.通过分岔分析,首先探讨了PDCD5和ETS剂量调控的p53动力学.在任何ETS剂量下,随着PDCD5浓度的增加产生了超临界Hopf分岔,系统由单稳态转为振荡.其次,在确定的ETS剂量下,讨论了PDCD5和激活的ATM降解速率对p53动力学的影响.随着这两个参数的变化,p53展现出丰富的动力学,包括单稳态、两个稳定的稳态、振荡以及单稳态与振荡共存的双稳态.通过研究这些参数对p53动力学的影响,可以在理解DNA损伤后的p53信号通路调控中起到一定的指导作用.     

P53信号通路的分岔分析和能量面

肿瘤抑制蛋白p53的动力学对细胞命运起到重要作用.基于p53信号通路,针对通路中的两个重要蛋白质PDCD5和ATM,考虑了PDCD5表达水平和ATM产生速率对p53动力学的影响.首先,在一定PDCD5表达水平下,给出p53关于ATM产生速率的典型余维一分岔图.进一步,通过PDCD5和ATM产生速率的余维二分岔图清晰看出它们对p53动力学的调控,并给出相应的时间历程图.最后,通过能量面进一步分析了p53动力学的稳定性.     

具有时滞的P53调控网络的动力学分析

肿瘤抑制蛋白P53的动力学在细胞受到压力后对细胞命运起到重要作用。P53动力学与DNA损伤强度和P53信号通路中蛋白质表达水平密切相关。最近的研究考虑了蛋白质PDCD5调控P53信号通路并分析了对P53动力学的影响,却忽略了通路中基因转录和mRNA翻译时滞的作用。在本文,针对PDCD5调控具有时滞的P53信号通路模型,分别考虑有无时滞的情况,分析了DNA损伤强度和PDCD5表达水平对P53动力学的影响。分岔分析显示,在没有时滞时,P53表达水平随着PDCD5表达的升高呈现出单稳态,振荡和高稳态的动力学,而时滞会扩大P53振荡的范围。同时通过能量面分析了P53动力学的稳定性。本文所获得的结果对DNA损伤后P53动力学的调控起到一定的指导作用。     

p53信号网络的非线性动力学研究

p53蛋白作为细胞内重要的肿瘤抑制因子,通过复杂的信号转导网络调节细胞生理活动,维护基因组的稳定性与完整性.p53网络能对细胞遭遇的一系列应激信号(如DNA损伤、致癌基因激活和端粒受损等)做出响应,启动DNA修复、细胞周期阻滞、细胞衰老或凋亡等来避免基因组缺陷的复制和遗传.p53蛋白浓度在细胞应激响应过程中呈现脉冲、开关等动力学行为,具有丰富的非线性特征.本文旨在综述p53网络动力学领域的最新进展,揭示细胞DNA损伤响应过程中p53动力学与功能之间的潜在联系.     

抑癌因子p14-ARF对p53-MDM2网络的影响

p53是一种重要的抑癌因子，可激活细胞周期阻滞、DNA损伤修复、衰老或凋亡，在细胞命运决定中起重要作用。用ATMp的表达水平代表DNA损伤强度，建立了由p14-ARF调控的p53-MDM2网络的数学模型。通过数值模拟，分析了ATMp和p14-ARF对p53-MDM2通路的影响。研究表明，较低的ATMp水平会使p53p稳定在低稳态，适当的ATMp会激活p53-MDM2网络的振荡。此外，p53p的表达水平随着p14-ARF表达水平的升高呈现出低稳态，振荡和高稳态的动力学。     

p53振子的形成机制及microRNA对p53目标基因表达的精细调控

肿瘤抑制因子p53调控着大量的基因,在肿瘤抑制中起着关键作用.实验结果表明,当DNA受损后,p53的表达呈现周期性振荡.已有的一些p53振子的理论模型,其振子产生机制通常依赖于p53和Mdm2之间相互作用的时滞因素.考虑基因表达的转录和翻译过程,运用动力学方程建模的方法,给出一种新模型,并利用Hopf分叉理论,给出p53振子产生的条件.数值模拟结果表明,与已有的时滞模型相比,该模型对参数具有更好的鲁棒性,较好地解释了p53振子的产生机制.最近的许多实验表明,p53调控着miR-34家族中大量microRNA的表达,这些microRNA又在后转录水平上对p53的下游目标基因起着调控作用.在这一模型基础上,研究microRNA加入p53调控网络后所起的调控作用,数值模拟结果初步表明,microRNA对p53下游目标基因表达起到了精细调控作用.     

PTEN对p53动态行为的影响

建立了一个p53蛋白信号网络,包括p53-Mdm2负反馈回路、p53-Wip1-ATM负反馈回路、p53-PTEN-PIP3-Akt正反馈回路.通过分析数学模型再次确认了p53-Mdm2、p53-Wip1-ATM反馈回路是p53振荡出现的必要条件.利用分岔分析等方法,发现低浓度的PTEN能缩短p53的振荡周期,而高浓度的PTEN能终止p53的振荡行为,说明了PTEN的促凋亡作用.结果对理解p53的动力学行为有一定意义.     

Killin介导p53信号通路的机理与其在细胞周期不同时期特异性分布的相关性研究

本研究中,通过检测killin在其它p53下游相关基因缺失的情况下能否激活细胞凋亡,证明了p53通过killin介导的S期抑制以及细胞凋亡与p21、puma和bax通路没有直接关系.另外通过将EGFP-PCNA和RFP-killin表达质粒共同转染到cosE5细胞中,并观察细胞处于不同时期时Killin蛋白的分布情况,发现在细胞S期中Killin与PCNA的核定位呈现相互排斥的点状分布,与先前BrdU标记结果吻合.这一结果再次印证了Killin在S期可能抑制DNA复制.同时Killin被观察到在非S期时聚集于核仁内,从而可能影响核糖体RNA的合成.这些发现意味着killin作为主要的p53靶基因之一,可能在细胞周期不同检查点进行调控.     

非线性单稳态系统中基于内禀振荡的随机共振

通过考察具有内禀振荡的单稳态非线性系统的随机振荡行为,研究了内禀振荡对噪声背景中微弱信号检测性能的影响.结果表明,输出信噪比和系统信噪比增益都表现出随机共振行为;该随机共振现象依赖于系统的选频特性,而系统的选频特性源于内禀振荡.该单稳态非线性系统表现出的这种源于内禀振荡的随机共振,可能为微弱信号检测系统的设计提供新思路.     

pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒的构建及在p44信号通路中的应用鉴定

p53基因是一种重要的抑癌基因,其产物能够与靶DNA特异性结合并激活转录参与诱导细胞凋亡,调控细胞周期,控制细胞的增殖与分化.p44蛋白主要定位于前列腺癌细胞的细胞质,促进癌细胞的增殖.通过shRNA沉默p44的表达后,LNCaP细胞的生长受抑制, p53靶基因TIGAR和GLIPR1的表达增加.为探寻p53是否介导p44对TIGAR和GLIPR1的作用,本研究构建了pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒,并将其分别转染经NT-shRNA慢病毒和p44-shRNA慢病毒感染的LNCaP细胞,比较两者荧光素酶活性.结果显示,重组质粒pGL3-4×PRE-E4-luc构建成功,为进一步研究p53在肿瘤发生发展过程中的作用通路提供了新的手段.但LNCaP细胞中p44并非通过p53作用于TIGAR和GLIPR1基因,具体机制仍有待进一步研究.     

Wip1对p53-Mdm2动力学的影响以及动力学分析

提出了p53-Mdm2和ATMp-p53-Wip1两条负反馈回路调控p53信号网络的数学模型,通过研究发现p53-Mdm2反馈回路对于p53脉冲的产生有一定的影响,与以往的研究吻合,更重要的是ATMp-p53-Wip1回路对p53脉冲也有着重要的影响.Wip1蛋白将会抑制ATM的磷酸化,从而减弱ATMp对p53的激活作用,但值得注意的是与Mdm2不同,Wip1虽然对p53脉冲有着重要的调控作用,但当Wip1浓度大于某一数值时,Wip1浓度的增加并不改变p53脉冲的振幅和周期.并且当p53-Mdm2和ATMp-p53-Wip1两条回路共存时,Wip1和Mdm2共同调节p53脉冲.     

携带p53基因重组腺病毒载体的构建

将pCMVp53重组转移载体经BamHI和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体.用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法(ELISA)测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达.     

基于植物p53保守序列构建RNAi的DNA片段方法

构建p53基因RNA干涉DNA片段的目的,是将其应用于植物悬浮培养中的细胞周期调节.依据拟南芥p53基因与其他高等植物具有高度保守区域的特点,合成其两个区域的核苷酸片段(Ⅰ和Ⅱ)及其相应的反向片段(Ⅰ′和Ⅱ′),并在Ⅱ和Ⅱ′端部分别引入内含子两个端部核苷酸序列.在相互连接后进行PCR选择扩增,其产物再与克隆载体连接并经过蓝白斑筛选获得重组DNA;在电泳和核苷酸测序鉴定后表明,最终得到了Ⅰ–5′–内含子–Ⅱ′–Ⅱ–内含子–3′–Ⅰ′序列的重组DNA片段.该片段两端含多克隆位点,通过插入植物的表达载体进入细胞基因组,在细胞中其转录产物将形成发夹结构,经胞内酶切后可以形成短的双链RNA片段,将具有干涉p53基因表达的功能.     

筛选p53靶向药物的细胞模型的构建

为了筛选可以恢复肿瘤细胞中p53功能的小分子,作者用表达野生型p53的人类直肠癌细胞HCT116建立了一株能够应答激活p53信号通路的荧光素酶报告基因的稳定细胞系,同时用表达野生型p53的人类骨肉瘤细胞U2-OS建立了一株能够应答激活p53信号通路的mCherry红色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系.为了检测筛选p53靶向药物的有效性,利用三种已知的以p53为靶点的小分子药物(cisplatin,doxorubicin以及Nutlin-3)处理这两种稳定细胞系,结果显示p53信号通路在这两个稳定细胞系中均能够被激活.为了探索小分子RNA作为恢复p53功能的靶标药物,并进一步验证这两种细胞模型用于药物筛选的可行性,分别检测了MDM2和MDMX的5个不同shRNA.通过比较HCT116稳定细胞的荧光素酶活性和U2-OS稳定细胞中荧光蛋白的荧光强度,我们筛选出了有效沉默MDM2或MDMX的shRNA.数据表明,这两种细胞模型不仅可用作筛选激活p53的小分子化合物的平台,而且可用于筛选激活p53信号通路的小分子RNA.     

DNA的识别分子及其识别模式

固有免疫以TLR9依赖和TLR9非依赖的方式对DNA识别,在保护性免疫和病理性自身免疫反应中发挥重要作用。目前发现TLR9,DAI（DLM-1／ZBPl）,RIG—I,尚未定义的识别B—DNA的分子,损伤DNA结合分子如：DNA—PKCS,Ku70,p53,ATM,ATR和含有SAP或PHD结构域等的分子可以识别DNA,并且分别以不同的识别模式识别细胞不同部位或不同类型的DNA。近几年来国内外针对DNA识别的研究较多并取得了重要进展,给研究保护性免疫和自身免疫提供了新的视野。文中结合作者所在实验室的研究探索,对DNA的识别分子和识别模式的研究进展进行综述。     

两种帕金森体外模型的构建及相关研究

为检测a-突触核蛋白(a-Synuclein)在人神经元母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中的表达,构建人野生型(WT)和A53T突变型a-Synuclein质粒(p EGFP-SNCA-WT和p EGFP-SNCA-A53T),经酶切鉴定无误后转染SH-SY5Y细胞,并对转染完成的细胞进行嘌呤霉素筛选,然后通过PCR法扩增转染后SH-SY5Y细胞的a-Synuclein片段,并对其进行测序,检测目的基因,运用Western blot法检测转染后SH-SY5Y细胞中a-Synuclein的表达.酶切鉴定结果表明p EGFP-SNCA-WT和p EGFP-SNCA-A53T质粒构建成功,嘌呤霉素筛选和转基因细胞a-Synuclein片段测序结果显示慢病毒表达载体能成功的整合到SH-SY5Y细胞基因组中,Western blot结果表明,转染后的SH-SY5Y细胞能成功的过表达a-Synuclein.a-Synuclein慢病毒表达载体构建成功,并且SH-SY5Y细胞作为宿主细胞能够表达a-Synuclein.为今后帕金森病(PD)体外模型的建立及帕金森病发病机制的研究奠定了基础.     

基于原子力显微镜研究p53蛋白与PBR322 DNA的相互作用

肿瘤(癌症)是由于细胞在复制过程中,DNA损伤不能修复导致细胞凋亡或者细胞无限增殖而形成的。DNA在细胞中转录和翻译都会涉及蛋白与DNA的结合,肿瘤抑制蛋白也是参与这一过程的关键蛋白之一。然而,众多研究发现,肿瘤抑制蛋白p53具有识别和修复损伤DNA的效果,对于细胞的凋亡、基因的保护和避免癌症发生有着重要的意义。有研究表明,金属镁离子和锌离子可以增强p53蛋白的结构稳定性和p53-DNA的亲和力。因此,我们基于原子力显微镜(AFM),直观地呈现出p53蛋白与PBR322环状DNA相互作用的图像,同时发现p53蛋白可以使环状DNA自身形成聚集或者相交。但是,对于长度相当的5 000bp的线状DNA几乎没有这样的效果,而对于20 000bp DNA不会出现这样的现象。然而,在高浓度镁离子环境下,环状DNA会扭转成为麻花状,即形成超螺旋结构。这一现象,可为p53蛋白功能和作用机理研究提供指导,也为癌症治疗、癌症药物开发以及癌症检测方法提供启发。     

乙酰基转移酶TIP60蛋白乙酰化位点定位的研究

乙酰基转移酶TIP60(tat-interaction protein,60ku)介导众多蛋白的乙酰化修饰,如核心组蛋白、p53、ATM、H2AX、RB和E2F1等,参与调控细胞凋亡、周期阻滞、DNA损伤修复和细胞衰老等多种重要细胞生理活动,并且与肿瘤发生密切相关.与另外2种乙酰基转移酶p300和PCAF相似,TIP60也可以介导自乙酰化.目前,TIP60自乙酰化修饰的精确位点和细胞功能并不清楚,因此在体外条件下,对TIP60蛋白的乙酰化位点进行了初步定位.构建了4种GST-TIP60原核表达质粒,利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达型菌株BL21系统,诱导表达并纯化含有TIP60全长和不同片段的GST融合蛋白,通过体外乙酰化实验证实TIP60蛋白的乙酰化位点集中在N端,而不是含有保守的MYST结构域的中间段.这些实验结果为进一步研究TIP60自乙酰化调控方式及其对TIP60蛋白细胞功能的影响提供了必要条件.     

神经生长因子125I偶联物诱导人胶质瘤U251细胞G2期阻滞

 观察¹²⁵I-NGF(神经生长因子)对U251细胞DNA的损伤作用,探讨¹²⁵I-NGF的抗肿瘤作用机制。应用微核测试和单细胞电泳等方法观察U251细胞DNA的变化,Western Blotting法检测细胞蛋白水平的变化,RT-PCR法检测Cyclin B1 mRNA水平的变化,微核测试和单细胞电泳等方法观察到¹²⁵I-NGF对U251细胞DNA的损伤作用。细胞周期检测及MPM-2/PI复染实验表明¹²⁵I-NGF诱导了U251细胞G₂期阻滞。Western Blotting检测表明,¹²⁵I-NGF可能通过活化ATM和ATR途径发挥抗肿瘤作用。¹²⁵I-NGF以剂量依赖性的模式减少了U251细胞Cyclin B1蛋白表达水平,但没有改变其mRNA的表达水平。在U251细胞中,磷酸化Chk1、Chk2和Cdc25c蛋白水平提高,而p53和p21水平保持不变。阐明了¹²⁵I-NGF通过对U251细胞DNA的损伤作用活化ATM和ATR通路,使多种蛋白的表达水平发生了改变,从而发挥其抗肿瘤的作用。     

人乳头瘤病毒HPV16E6的表达促进角质生成细胞凋亡的发生

为探讨HPV16早期基因E6的表达对角质生成细胞NIKS凋亡表型的影响及可能的机制,经培养稳定表达HPV16E6的角质生成细胞NIKS;使用不同的DNA损伤剂处理转染后细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况;建立表达HPV16E6突变体Y54D及F2V的p53降解缺陷型NIKS细胞系并用DNA损伤剂处理,流式细胞术检测凋亡情况.研究显示,流式细胞术结果显示稳定表达E6的细胞系在足叶乙甙、丝裂霉素及紫衫醇处理后发生明显的细胞凋亡;表达Y54D或F2V的NIKS细胞经DNA损伤剂处理后凋亡明显低于正常E6表达细胞.研究表明,人乳头瘤病毒E6的表达能够促进角质生成细胞凋亡的发生,这种促凋亡作用与细胞内p53的表达相关.