扇形游仆虫谷胱甘肽过氧化物酶cDNA的克隆及序列特征分析

采用cDNA 末端快速扩增( rapid amplification of cDNA ends,RACE) 技术,对纤毛虫原生动物扇形游仆虫（Euplotes vannus）GPx cDNA特征进行分析. 克隆到扇形游仆虫GPx cDNA全长序列为672bp,该序列编码182个氨基酸,属硫氧还蛋白超家族,且具有一定的保守性,含有3个催化残基和3个特征性基序．氨基酸序列进化分析结果表明,扇形游仆虫与其他纤毛虫物种同源性较高,亲缘关系较近,研究结果为扇形游仆虫GPx在生态毒理学的应用提供基础信息．     

八肋游仆虫蛋白激酶A的克隆及原核表达分析

为了研究低等真核生物中蛋白激酶PKA(cAMP-dependent protein kinase A)的生物学功能,以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)为实验材料,通过生物信息学方法分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,发现八肋游仆虫中编码蛋白激酶PKAc(PKA催化亚基)的基因只有一种。通过PCR扩增获得游仆虫PKAc基因(EoPKAc),分析表明EoPKAc基因全长1158bp,不含有内含子,开放阅读框981bp,编码326个氨基酸。序列比对结果显示EoPKAc含有与其它已知蛋白激酶相同的11个亚结构域(subdomain)以及一些重要的保守氨基酸。构建原核表达质粒pGEX-6P-1-PKAc,转化至大肠杆菌BL21中,EoPKAc获得高效表达,经GST柱亲和层析后获得较高纯度的EoPKAc蛋白,表达产物经Western blotting检测为阳性。     

扇形游仆虫谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆和序列特征分析

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,对纤毛虫原生动物扇形游仆虫(Euplotes vannus)谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)cDNA特征进行分析.获得扇形游仆虫GPx cDNA全长序列,为672 bp,编码182个氨基酸,属硫氧还蛋白超家族,含有3个催化残基和3个特征性基序.氨基酸序列与其他纤毛虫物种同源性较高,亲缘关系较近.     

寡毛双眉虫Diophrys oligothrix形态和形态发生的研究

报告了寡毛双眉虫(Diophrys. oligothrix) 的形态学特征以及它在无性分裂时期形态发生的全过程。观察了前仔虫口围带的形成过程,并将其与亲代的口围带进行比较,认为前仔虫口围带是经过重建的。从口器、大核等的情况反映出寡毛双眉虫与游仆虫、盾纤虫以及尾刺虫在进化上的关系。并认为前、后仔虫形成后仍继续恢复其典型的纤毛模式。     

细胞核密码表进化树的重建

提出距离幅定义规则,重建了标准表与各个细胞核非标准密码表的进化树,说明密码反常不是随机的,现存的非标准密码表都在标准表进化的路径上,密码进化总是倾向于无意义密码子减少的方向.     

八肋游仆虫组织蛋白酶B-1的克隆、表达和性质分析

为研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的生物学功能,选用组织蛋白酶B-1(EoCTSB-1)为研究对象,通过PCR扩增获得EoCTSB-1的基因。利用生物信息学软件分析表明八肋游仆虫CTSB-1基因全长为980bp,不含有内含子,开放阅读框为862bp,编码286个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示八肋游仆虫中组织蛋白酶B-1具有保守的催化活性位点,但缺少信号肽和封闭环结构。构建重组表达质粒pET30a-EoCTSB-1,并转入原核细胞中表达,经镍柱亲和层析以及变复性处理后获得较高纯度的EoCTSB-1蛋白,表达产物利用His-Tag的抗体进行western印迹检测,结果显示阳性。利用底物Z-Phe-Arg-AMC测得EoCTSB-1的最适温度为35℃,最适pH是5.0。     

无义密码对线粒体密码进化的影响

遗传密码的起源与进化是理论生物学研究的一个基本问题.以线粒体密码为例,讨论密码进化关系构建的不同规则,分析密码进化中重要影响因素——无义密码子的再定义及其逆过程.终止信号与氨基酸间的距离是密码进化关系构建中的关键,在密码进化中无义密码子突变可以频繁进行,存在干涉现象,且进化倾向于无义密码子减少的方向.     

UPF2介导八肋游仆虫NMD途径SURF和EJC的耦联

通过生物信息学分析发现八肋游仆虫的UPF2(EoUPF2)包含三个串联的MIF4G(middle domain of translation initiation factor 4G)结构域和一个C末端UPF1的结合区域。对24种UPF2氨基酸序列的进化关系分析发现,EoUPF2与酿酒酵母的UPF2(ScUPF2)进化关系较为接近。InterPro database数据库分析结果显示,二者的核心结构域非常相似。酵母双杂交和Pull down实验证实:EoUPF2的C末端与EoUPF1的CH结构域相互作用;EoUPF2在没有UPF3存在的情况下,通过其MIF4G结构与外显子连接复合体(exon-exon junction complex,EJC)核心因子Y14a和Y14b相互作用。β-半乳糖苷酶实验证实EoUPF2与Y14a的作用更强一些。qPCR分析结果排除了EoUPF2与Y14a和Y14b相互作用与Y14a和Y14b本身的拷贝数有关。由此我们推断,在八肋游仆虫的NMD识别无义mRNA过程中,EoUPF2通过与Y14相互作用,介导了UPF1与无义mRNA上的外显子连接复合体的耦联,启动了无义mRNA的识别过程。     

中心蛋白3定位于游仆虫细胞中形成棘毛的基体上

中心蛋白与中心体(或基体)有着密切关系,作为一种细胞骨架蛋白,形成原生动物巨大的细胞骨架网络;为了研究从八肋游仆虫细胞中克隆到的一种中心蛋白基因(EoCen3)的功能,我们构建了八肋游仆虫细胞大核人工染色体pBTub-Tel,定位分析该基因所表达的中心蛋白在细胞中的分布和行为.该人工染色体利用密码子优化的增强型绿色荧光蛋白基因作为标记,在八肋游仆虫细胞中实现高表达,避免用抗生素作为标记对该细胞的喂养产生影响.定位结果显示,该类中心蛋白特异定位于游仆虫形态发生过程中的基体上.在八肋游仆虫无性生殖细胞分裂的起始阶段基体开始发育,首先形成第一个基体,Eo-Cen3定位于新形成的基体中;随后基体开始复制,EoCen3定位于正在复制的基体中.在细胞发育过程中绿色荧光标记的基体成倍增加,说明EoCen3与参与棘毛形成的基体的复制有一定的关系.     

一种游仆虫无性生殖周期中大核及其DNA含量的变化

应用光学显微镜、显微光度计和定量细胞化学技术研究了一种游仆虫无性生殖周期中大核及其 DNA 含量的变化特征,获得如下结果:(1)游仆虫细胞周期分成 G_1期、S 期和 D 期,各个时期在整个细胞周期中所占的时间速率分别为36%、59%和5%。(2)游仆虫细胞周期中,G_1期大核迅速增大,但此时大核无 DNA 合成现象,DNA 分布密度随大核增大而降低;S 期大核前期增大,此后变小,大核 DNA 含量连续增加,大核 DNA 分布密度也随着增高。8期结束后,大核 DNA 含量相当于 G_1大核的两倍;D期大核又显著增大,DNA 分布密度稍高于 G_1期大核的水平。(3)由游仆虫孚尔根反应大核的形态,大核 DNA 三维吸收图像和显微光度术定量分析数据表明,游仆虫大核 DNA 含量的变化仅发生在 S 期,S 期大核中 DNA 合成与大核改组带相联系。     

八肋游仆虫中ECD1基因的克隆及序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了异染色质的形成及转录沉默复合物的形成.原生动物游仆虫细胞中既含有转录活跃的大核也含有转录沉默的小核.本实验应用PCR技术从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中获得了一个编码含有CHROMO结构域的基因ECD1(Euplotes chromo domain-con-taining protein 1)(GeneBank登录号为FJ357578).大核中含有该基因的微小染色体全长1105 bp.小核中该基因内无内部删除序列IES的存在.通过RT-PCR,证实该基因开放阅读框为645 bp.大核基因中含有三个内含子,转录过程中这些内含子均符合一类内含子GU-AG剪切规则.DNAstar软件分析,该基因编码的蛋白质包含214个氨基酸,分子量24.7 kDa,等电点为5.48.结构域聚类分析表明Ecdl蛋白可能执行与四膜虫异染色质蛋白Pddlp和Pdd3p相似功能,参与大核发育过程中异染色质的形成和IES序列的删除.     

近亲游仆虫的无性生殖和皮层细胞骨架的研究 Ⅰ.形态和形态发生

应用蛋白银染色方法和扫描电子显微镜技术,首次详细地观察了近亲游仆虫(Euplotes affinis Dujardin)的形态和形态发生,并对新纤毛小器官原基的产生、发育和老纤毛器的关系等进行了讨论.     

近亲游仆虫的无性生殖和皮层细胞骨架的研究——Ⅰ.形态和形态发生

应用蛋白银染色方法和扫描电子显微镜技术,首次详细地观察了近亲游仆虫(Euplotes affinis Dujardin)的形态和形态发生,并对新纤毛小器官原基的产生、发育和老纤毛器的关系等进行了讨论。     

伍氏游仆虫无性生殖中前仔虫口围带的起源

关于伍氏游仆虫(Euplotes woodruffi)的形态和形态发生,已经有人应用银浸法和蛋白银染色等方法在光镜水平上做了深入的研究,有详细的报道.据光镜水平上的观察一般认为,游仆虫二分裂期间前仔虫口纤毛器是继承亲体上原有的老结构而来的.最近,作者应用扫描电镜方法在亚显微水平上发现,这种游仆虫无性生殖中前仔虫口围带是在原老口围带位置更新发育而来的.现将结果简报如下. 1材料和方法     

一种游仆虫无性生殖周期中大核及其 DNA 含量的变化

应用光学显微镜、显微光度计和定量细胞化学技术研究了一种游仆虫无性生殖周期中大核及其DNA含量的变化特征,获得如下结果:(1)游仆虫细胞周期分成G_1期、S期和D期,各个时期在整个细胞周期中所占的时间速率分别为36%、59%和5%。(2)游仆虫细胞周期中,G_1期大核迅速增大,但此时大核无DNA合成现象,DNA分布密度随大核增大而降低;S期大核前期增大,此后变小,大核DNA含量连续增加,大核DNA分布密度也随着增高。S期结束后,大核DNA含量相当于G_1大核的两倍;D期大核又显著增大,DNA分布密度稍高于G_1期大核的水平。(3)由游仆虫孚尔根反应大核的形态,大核DNA三维吸收图像和显微光度术定量分析数据表明,游仆虫大核DNA含量的变化仅发生在S期,S期大核中DNA合成与大核改组带相联系。     

伍氏游仆虫无性生殖中前仔虫口围带的起源

关于伍氏游仆虫(Euplotes woodruffi)的形态和形态发生,已经有人应用银浸法和蛋白银染色等方法在光镜水平上做了深入的研究,有详细的报道。据光镜水平上的观察一般认为,游仆虫二分裂期间前仔虫口纤毛器是继承亲体上原有的老结构而来的。最近,作者应用扫描电镜方法在亚显微水平上发现,这种游仆虫无性生殖中前仔虫口围带是在原老口围带位置更新发育而来的。现将结果简报如下。     

小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)皮层微管胞器的荧光标记

应用荧光紫杉醇直接荧光标记和抗a-微管蛋白抗体免疫荧光标记,显示了纤毛虫小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)皮层纤毛器微管、纤毛器基部附属微管和背皮层表面微管等结构,以及皮层纤毛器微管的形态发生.结果表明,该游仆虫背皮层表面网在形态上与嗜银网相一致,也是一种微管类细胞骨架;与其他几种游仆虫比较,前仔虫口纤毛器和背皮层纤毛器微管的形态发生存在不同的模式,其形态发生可能具有种的特异性,可以作为种的分类依据之一.此外,与FLUTAX(fluorescence taxoid)标记方法相比较,抗α-微管蛋白抗体免疫荧光标记能较清晰地显示游仆虫背皮层表面微管网及早期发生的额腹横棘毛原基和背触毛原基,推测该游仆虫的细胞背表面微管网与其他微管结构其微管蛋白组分可能存在差异,且形态发生中伴随着皮层纤毛器微管的组装和成熟,其微管蛋白组分同时也在不断发生变化.     

RNA干扰阔口游仆虫γ-微管蛋白基因表达的研究

根据阔口游仆虫微管蛋白基因序列设计1对引物,扩增出692bp的γ-微管蛋白基因片段,将之重组到L4440载体中,重组质粒转化到RNAase缺陷型E.coli HT115菌株中,并用IPTG诱导双链RNA的表达,将经诱导后的重组菌喂食游仆虫,诱导出RNAi表型,具体表现为虫体变小、变圆,约两周后游仆虫全部死亡.电镜观察表明,经诱导后的游仆虫部分纤毛杆横切面显示结构为9+0,部分纤毛杆膨胀变形并开始瓦解,原高度有序的微管排列结构消失.进一步证实喂食法可有效地产生RNAi,γ-微管蛋白基因沉默后游仆虫无法维持正常形态并死亡,观察到纤毛杆的超微结构发生明显的变化,由此推测γ-微管蛋白的表达和细胞调控在游仆虫细胞微管骨架的装配及其细胞生命活动中起重要作用.     

八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子金属离子结合性质的光谱研究

Ca~(2+)在中心蛋白调节许多生理过程并发挥生物功能中起到很重要的作用.本文分别使用TNS、Tb~(3+)为荧光探针研究了八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子(P_(12))与不同稀土离子的结合性质及对其构象变化的影响和P_(12)与Tb~(3+)结合的热力学性质.结果表明,在pH 7.4、0.01 mol/L Hepes条件下,中心蛋白与稀土离子结合的稳定性和稀土离子饱和的蛋白质疏水区暴露程度与稀土离子静电势成正比;稀土离子主要以静电作用占据八肋游仆虫中心蛋白N-端区域的金属离子结合部位.     

生命密码的突变危险性理论

目的梳理迄今为止多种主体密码起源及进化假说,研究突变危险性理论的本质内容、理论特点和优势并作相应评述。方法文献考证与概念分析。结果揭示了突变危险性理论的本质内容及理论特色。结论生命密码的突变危险性理论有其自身理论体系的简明性和逻辑性,继承了Crick的摆动假说和冻结偶然性理论,并将标准码和反常码的研究纳入了一个统一的理论框架之下。