棉花原生质体“供-受体”双失活融合产生种间杂种植株及其鉴定

采用“供-受体”双失活融合模式, 以陆地棉品系YZ-1原生质体为受体, 以野生棉G. davidsonii原生质体为供体, 开展不对称融合. 融合前, 陆地棉品系YZ-1原生质体经过0.5 mmol/L碘乙酰胺(IOA)室温下处理20 min, 野生棉G. davidsonii原生质体经过38.7 J/cm2的紫外线(UV)处理30?s, 能有效地抑制亲本原生质体的生长. 将上述条件下分别钝化处理的双亲原生质体采用电诱导融合后进行培养, 获得再生植株. 对获得的杂种植株进行形态学、细胞学及分子标记检测. 大部分再生植株表现出新形态, 部分表现亲本中间型, 少数偏向受体亲本. 融合植株的染色体数目在40~73之间. 随机扩增多态性DNA标记(RAPD)和简单重复序列(SSR)分析证实了再生植株的杂种真实性. 而细胞质基因组的酶切扩增多态性序列(CAPS)和叶绿体SSR(cpSSR)分析结果显示, 杂种的线粒体和叶绿体发生了重组. 本研究是棉花中开展“供-受体”双失活融合模式的首次报道, 是继对称融合和基于紫外线处理的不对称融合之后在棉花原生质体融合方面又一新的进展.     

芸苔属花粉-体细胞杂种植株的生长发育及分子生物学鉴定

“配子-体细胞杂交(gameto-somatic hybridization)”是植物性细胞操作研究的重要组成部分,近十年来取得了较大进展.小孢子四分体原生质体.幼嫩花粉原生质体以及成熟花粉原生质体与体细胞原生质体的融合先后均再生杂种植株成功.但迄今的研究多集中于茄科植物,而且关于杂种植株的结实等方面尚无肯定的报道.李昌功等由芸苔属幼嫩花粉原生质体与下胚轴原生质融合再生了3个小植侏,并经染色体计数和酯酶同工酶酶谱分析初步鉴定出一株是异源三倍体,两株是异源四倍体.本文报道这3个小植株的生长发育情况以及运用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)标记技术进一步对其杂种特性鉴定的结果.1 材料与方法1.1 材料及杂种植株生长发育的观察将青菜(Brassica chinensis L.)幼嫩花粉原生质体与甘蓝型油菜(B.napus L.)下胚轴原生质体融合再生的3个小植株通过切段繁殖的方法扩增其数量,将高达5cm以上的植株移入田间.以同期的双亲植株作对照,观察比较其生长发育情况.用荧光素二醋酸酯(FDA)染色反应测定成熟花粉的生活力.解剖果实以检查种子形成情况.     

小麦+多花黑麦草不对称体细胞杂种的分子鉴定

为向小麦转移多花黑麦草的有利基因，创建小麦新胞质种质，进行了小麦与多花黑麦草原生质体电融合的研究，成功地再生了小麦 多花黑麦草体细胞杂种，经6种限制性内切酶，13个探针（其中含9个线粒体探针，3个叶绿体探针和1个核基因探针）的73种酶/探针组合检测，小麦与多花黑麦草间具有很高的多态性，分子鉴定表明，约93.4%的再生植株为真杂种，所得到的体细胞杂种为高度不对称的体细胞杂种，小麦和多花黑麦草的线粒体和叶绿体在体细胞杂种细胞中不共存。     

小麦幼穗愈伤组织原生质体培养再生植株

小麦(Triticum aestivum L)作为一种主要禾谷类粮食作物,其原生质体培养一直受到重视。然而由于技术难度较大,直到最近才有第一篇有关小麦花药愈伤组织悬浮培养物原生质体再生成小植株的报道。我们经过一年多的反复实验,已从幼穗切段起始的愈伤组织分离的体细胞原生质体培养得到大量胚状体,并进一步分化成了小植株。     

不对称体细胞杂交转移疣粒野生稻对水稻白叶枯病的抗性

疣粒野生稻(O. meyeriana (Zoll. etMor. exSteud.))对水稻白叶枯病具有高度的抗病性, 为转移这种抗病性, 进行了栽培稻+疣粒野生稻不对称体细胞杂交. 以软X射线处理过的疣粒野生稻原生质体作供体, 来源于栽培稻品种02428的原生质体经碘乙酰胺(IOA)失活后作受体, 采用PEG法诱导二者的原生质体融合. 由于代谢功能互补, 融合物经培养后得到623块愈伤组织, 最终分化出72株再生植株. 这些融合植株形态上与栽培稻接近, 采用微卫星分子标记进行了杂种鉴定. 细胞学分析表明, 融合杂种根尖细胞染色体数目在27~38条之间变化. 在成株期对融合植株进行了白叶枯病接种鉴定, 结果显示疣粒野生稻对水稻白叶枯病的抗性成功地转移到栽培稻中.     

第一个动植物界间的人工杂种

在深入了解活体细胞微细结构的基础上,目前有关细胞操作以及细胞培养的研究已经较为普遍:从细胞游离出整条染色体作遗传学分析;植物原生质体(除去细胞壁的细胞)培养分化再生植株。用嫁接法证实了块茎积蓄异体组织同化产物的潜力。如此产生的拼盘式杂种实用价值固然不大,但是真正的蕃茄与马铃薯的属间杂种已经问世。多数个体都能够正常地生长发育。     

小麦与新麦草及高冰草属间不对称体细胞杂交的植株再生

在植物体细胞杂交研究中,供体-受体不对称融合方法近年来倍受重视。人们常用X-或γ-射线辐射一方亲本作融合供体,以获得胞质杂种或不对称核杂种。但至今紫外线在不对称融合中的应用还未见报道。禾谷类的体细胞杂交,在水稻上已有较大进展,但在小麦进展缓慢,仅有小麦与多年生黑麦草及小麦与裸燕麦的原生质体融合获杂种愈伤组织的报道。近年来,我们曾以小麦与~(60)Co-γ射线处理的簇毛进行体细胞杂交,首次获得小麦不对称体细胞杂种植株。现在我们报道小麦与紫外线照射的新麦草(Psathyrostachys juncea (Fisch) Nevski 2n=14)和高冰草(Agropyron elongatum (Host) Nevski 2n=70)的属间体细胞杂交也获得成功。     

小麦与新麦草及高冰草属间不对称体细胞杂交的植株再生

<正> 在植物体细胞杂交研究中,供体-受体不对称融合方法近年来倍受重视。人们常用X-或γ-射线辐射一方亲本作融合供体,以获得胞质杂种或不对称核杂种。但至今紫外线在不对称融合中的应用还未见报道。禾谷类的体细胞杂交,在水稻上已有较大进展,但在小麦进展缓慢,仅有小麦与多年生黑麦草及小麦与裸燕麦的原生质体融合获杂种愈伤组织的报道。近年来,我们曾以小麦与~(60)Co-γ射线处理的簇毛进行体细胞杂交,首次获得小麦不对称体细胞杂种植株。现在我们报道小麦与紫外线照射的新麦草(Psathyrostachys juncea (Fisch) Nevski 2n=14)和高冰草(Agropyron elongatum (Host) Nevski 2n=70)的属间体细胞杂交也获得成功。     

利用C基因组C0t-1 DNA比较分析稻属A, B, C, D基因组

以药用野生稻(CC) C₀t-1 DNA作为探针, 对其自身体细胞染色体和栽培稻×药用野生稻杂交后代F1, 回交后代BC₁以及宽叶野生稻(CCDD), 高秆野生稻(CCDD)和斑点野生稻(BBCC)体细胞染色体进行荧光原位杂交实验. 在药用野生稻体细胞染色体中, 同源染色体呈现相似的C₀t-1 DNA杂交带型, 并对其核型进行了同源性聚类. 对F₁ (AC)和2个BC₁ (AAC和ACC)的杂交实验中, 在不封阻的情况下, 药用野生稻C基因组C₀t-1 DNA探针能清晰地鉴别C组染色体, 而在A组染色体上信号分布很少, 说明A基因组与药用野生稻C基因组中高度重复序列同源性较低. 此外, 对宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻3个四倍体体细胞染色体进行了FISH分析, 在24条C组染色体上均可观察到较强的杂交信号, B和D基因组的24条染色体上信号较少, 但在D组染色体上的信号较B组染色体的多, 说明D与C基因组的亲缘关系较B与C基因组的近. 进一步分析发现, 高杆野生稻D组染色体上的杂交信号要比宽叶野生稻D组染色体上的杂交信号多, 说明高杆野生稻的D基因组与C基因组的同源性要高, 这可能是高秆野生稻和宽叶野生稻同属于CCDD染色体组型但可区分为不同种的原因之一. 上述结果表明, C₀t-1 DNA具有很强的种的特异性和依赖基因组型的特异性, 利用C₀t-1 DNA作探针更能有效地对不同基因组进行FISH鉴定. 同时, 本研究采用F₁植株和BC₁植株, 即1个二倍体和2个三倍体人工选育杂种, 与宽叶野生稻、高杆野生稻和斑点野生稻进行了基于C基因组C₀t-1 DNA杂交的比较分析, 对稻属异源四倍体的可能起源机制进行了初步探讨.     

普通小麦与簇毛麦的不对称体细胞杂交及植株再生

体细胞杂交是作物育种的新途径,已经取得了很大进展.不对称融合技术主要通过射线辐照供体细胞,使只有胞质基因或部分核基因进入受体,从而增加获得可育杂种植株的可能性,为有性不亲和的种属间的杂交创造了有利的条件.簇毛麦(Haynaldia villosa,2n=14,VV)属于小麦亚族簇毛麦属.它具有小麦缺乏的许多优点,如高度抗病性、高蛋白质含量及分蘖能力强等.但小麦     

白芥×甘蓝F1代及BC1代单体异附加系的GISH分析

以白芥(Sinapis alba L)为母本, 甘蓝(Brassica oleracea var alboglabra)为父本进行属间杂交, 获得了不育及半不育的两种F₁植株, 再以半不育的F₁植株作母本, 甘蓝作父本进行回交, 获得了BC₁植株. 利用基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH), 结合双色荧光原位杂交(dual-colour fluorescence in situ hybridization, dcFISH)技术, 鉴定出不育F1植株有21条染色体, 其中9条来自甘蓝, 12条来自白芥, 属含1套甘蓝染色体及1套白芥染色体的预期杂种; 半不育F1植株有30条染色体, 其中18条来自甘蓝, 12条来自白芥, 属含2套甘蓝染色体及1套白芥染色体的非预期杂种, 其花粉母细胞(PMC)减数分裂中期Ⅰ最多出现3个C-S三价体, 减数分裂后期Ⅰ白芥染色体出现不同的分离比例. GISH分析结果表明, 从BC₁植株中鉴定出了1株甘蓝-白芥单体异附加系, 其有丝分裂中期相有19条染色体, 18条来自甘蓝, 附加的1条来自白芥; 减数分裂中期Ⅰ显示9个甘蓝的二价体及1个白芥的单价体, 有时白芥的单个染色体与甘蓝的染色体形成了可能的三价体. 甘蓝-白芥单体异附加系的获得为白芥基因渗入、基因定位与克隆奠定了基础.     

亚洲栽培稻与宽叶野生稻种间杂种的获得及其原位杂交分析

将亚洲栽培稻(Oryza sativa, 染色体组型为AA)与宽叶野生稻(O. latifolia, 染色体组型为CCDD)进行杂交, 结合胚拯救手段, 获得了这两个种的种间杂交种. 杂种F₁在株高、分蘖力、生长繁茂性等方面表现明显的杂种优势, 穗部性状明显偏向于父本宽叶野生稻的特征, 表现为长芒、小粒、大而外露的紫色柱头极易落粒. 根尖细胞染色体鉴定证明杂种染色体数为2n = 36. 进一步利用基因组原位杂交(genomic in situ hybridization, GISH)和荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)技术, 鉴定了杂种F1的染色体组成及其在减数分裂中的配对行为. 结果表明, 杂种染色体的组成为ACD, 在减数分裂中, 绝大部分染色体以单价体形式存在, 很少有配对现象发生, 因而杂种表现完全雄性不育.     

含多个重复序列的小麦VER2基因启动子驱动基因转录受春化作用调控

为了进一步了解VER2基因的表达模式及其启动子的功能, 从小麦可转化的人工染色体基因组文库中获得41.7 kb含VER2基因的TAC克隆. 序列分析显示, 其含有11个推测基因, 其中第3个基因的外显子完全与VER2基因的cDNA序列同源. VER2基因的启动子存在3个小的重复序列, 被另外2个大重复序列所分割. 对上游启动子区的响应元件分析结果表明, 其包含ABA响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(Me-JARE)、低温响应元件(LTR)、胚乳特异性表达元件以及参与淀粉酶合成的元件和类似GA响应元件等. 利用基因枪的方法, 将VER2启动子(&#8722;5895~+73)驱动GFP报告基因的瞬间表达载体转入经春化处理或未春化处理的小麦幼叶中, 结果发现, GFP在春化处理的幼叶中表达, 而在未春化处理的幼叶中不表达, 说明春化作用是VER2启动子在冬小麦幼叶中驱动基因转录所必需的.     

桃(Prunus persica)中2个MADS box基因功能的初步鉴定和遗传作图

我们在以前的研究中克隆了2个桃MADS box 基因, PpMADS4和PpMADS6, 它们分别为AGAMOUS (AG)和FRUITFULL (FUL)的同源基因, 本研究把它们进一步转入拟南芥中分析它们的功能. 转基因结果表明, 这2个基因都能导致拟南芥早花, 二级花序减少, 出现顶端花, 但PpMADS4与PpMADS6对拟南芥花器官有截然不同的影响. PpMADS4引起转基因植株花器官同源异型转变: 萼片心皮化, 花瓣雄蕊化; PpMADS6转基因植株表现为花瓣、雄蕊和心皮花器官数目的增加. 它们对果实发育也产生不同的影响: PpMADS4转基因植株的角果在伸长期花的外2轮萼片和花瓣不脱落; PpMADS6转基因植株的角果成熟后不开裂, 并可诱导从一朵花中长出多个果角. 这些结果表明, PpMADS4在拟南芥中可模拟AG的功能, 而PpMADS6与拟南芥FUL功能相似. PpMADS6对花器官数目的影响暗示FUL同源基因具有调节花器官数目的新功能. 通过RT-PCR分析花器官发育和控制顶端分生组织的基因表达, 结果表明, PpMADS6诱导产生超数花器官可能是通过控制CLV-WUS通路的基因来实现的. 此外, 将PpMADS4转化为一个SSR标记, 并将其定位在桃属植物的G5 连锁群上, 与PpMADS6基因位于同一染色体区段上. 最后, 对PpMADS4和PpMADS6在农作物及果树育种上的潜在应用价值进行了讨论.     

水稻单端体的获得及其分子细胞学鉴定

从籼稻品种中籼3037第1染色体短臂、第4染色体长臂及第11染色体长臂端三体的自交后代中, 选择形态性状出现明显变异但体细胞染色体数目仍为2n = 24的个体. 用水稻着丝粒特异的BAC克隆17p22为探针对有丝分裂早中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)分析, 各筛选到了一单端体植株, 其体细胞中各含有一条端着丝粒染色体. 进一步分别以位于第1染色体短臂、第4染色体长臂及第11染色体长臂上的特异分子细胞学标记a0059H02, a0034E24及a0071H11为探针, 对以上3个单端体的有丝分裂早中期染色体及减数分裂粗线期的染色体进行荧光原位杂交分析, 证明这些变异株确为第1染色体短臂、第4染色体长臂和第11染色体长臂的单端体. 这些单端体的植株矮小, 结实率较低.     

OsCENH3-GFP融合转基因水稻的获得及其遗传应用

通过农杆菌介导的方法, 将水稻组蛋白H3与绿色荧光蛋白嵌合基因(OsCENH3-GFP)导入水稻品种中籼3037中, 经PCR及Southern blot检测, 证明该嵌合基因确已整合到水稻的基因组中. 该转基因植株发育正常, 有丝分裂及减数分裂行为均正常. 对T0及T1代转基因水稻植株有丝分裂和减数分裂过程中GFP与水稻CENH3表达关系的研究结果表明, CENH3的表达部位与GFP的表达部位完全重叠, 说明GFP与水稻CENH3已构成融合蛋白, 并且定位于染色体的着丝粒部位. 为探索该转基因植株在水稻遗传及分子生物学研究中的作用, 利用花粉母细胞减数分裂偶线期染色体, 借助水稻着丝粒串联重复序列CentO的FISH, 发现GFP信号与CentO信号完全重叠, 证明CentO序列确实为水稻不同染色体功能性着丝粒的主要成分. 利用该转基因植株, 分别制作根尖细胞有丝分裂染色体和花粉母细胞减数分裂染色体制片, 与anti-α-tublin抗体和anti-PAIR2抗体进行荧光免疫染色反应, 表明该转基因植株携带GFP标记的着丝粒, 可以与其他分子生物学手段相结合, 并能在活体细胞及组织内十分方便地显示每一染色体功能性着丝粒位置, 为深入研究着丝粒的功能提供了宝贵的遗传材料.     

陆地棉×索马里棉(G.somalense)杂种的研究和利用

棉属野生种索马里棉种(G.somalense,Hutch)原产于非洲东北部沙漠地带,属于E_2染色体组,2n=26.该棉种具有抗干旱和抗棉铃虫特性,目前,国内外对于该棉种的开发和利用,至今没有成功的报道.1984年我组采用种间杂交,施用植物生长激素(GA3,50×10~(-6)g,NAA40×10~(-6)g),杂种胚离体培养,及同步利用秋水仙碱溶液进行染色体加倍一正套技术,成功地得到可育的陆地棉与索马里棉(G. somalense)的杂种F_1植株,经过回交和多年人工选     

尾状山羊草C基因组特异重复序列的克隆

pAeca 2 1 2序列长 2 0 4bp ,G +C含量为 5 1 % ,除着丝点和次缢痕外 ,它散布于C基因组的 7对染色体上 .与基因库登记注册的 31 6 893个DNA序列进行的同源性比较表明 ,它是尾状山羊草C基因组的一个新的散布特异重复序列 .在供试的禾本科植物中 ,除黑麦外 ,pAeca 2 1 2与其他基因组几乎无杂交信号 ,是研究小麦族起源与进化及C染色质检测的一个有效的分子标记 .     

一个编码玉米转译起始因子新基因的克隆

采用DD PCR方法比较玉米杂种一代及其亲本苗期基因表达产物mRNA的差异 ,分离并鉴定出一个玉米杂种一代超亲表达的cDNA .以该cDNA为探针从cDNA文库中筛选到一个全长的cDNA克隆 (ZH0 1) .ZH0 1长 1780bp ,5′端非编码区 112bp ,3′端非编码区 395bp ,开放阅读框共编码 4 14个氨基酸 .序列同源比较表明 ,ZH0 1为一个亲的玉米转译起始因子eIF4A基因家族成员 .     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.