Foxo1突变体转基因,ob/ob小鼠建立与表型分析

Foxo1是瘦素作用的负调控因子,实验室前期工作发现,其突变体Foxo1ΔDBD可导致转基因小鼠体重降低等表现型,本实验旨在研究转基因小鼠此表型与瘦素作用的关系.首先采用ALZET?渗透泵的方法对成年雄性的具有瘦素基因缺陷(ob/ob)小鼠进行10 d的瘦素处理,使其获得生育能力,然后采用动物杂交的方法制备双基因改造鼠,即ob/ob基因遗传背景的Foxo1ΔDBD转基因小鼠(Foxo1ΔDBD/+,ob/ob).经PCR扩增的方法进行基因型鉴定后,对双基因改造鼠的体重、体温等表型进行分析.结果显示:①植入含瘦素溶液的ALZET?渗透泵10 d后的4只雄性ob/ob小鼠全部获得了生育能力.②成功制备了46只双基因改造鼠,39只ob/ob小鼠等.③表型分析结果显示,无ob/ob遗传背景的转基因Foxo1ΔDBD小鼠(Foxo1ΔDBD/+)与野生型小鼠相比,体重显著性降低(P0.05),棕色脂肪内的UCP1转录水平显著升高(P0.05);而双基因改造鼠和ob/ob小鼠相比,体重、体温、空腹血糖和采食量均无显著性差异(P0.05),且UCP1转录水平上的表达也无显著性差异(P0.05).本实验成功制备了双基因改造鼠,并进行了表型分析,结果表明Foxo1ΔDBD转基因小鼠的体重降低和棕色脂肪UCP1转录升高等表现依赖瘦素的作用.     

MicroRNA-122过表达转基因小鼠的建立

目的:建立microRNA-122 (mir-122)过表达转基因小鼠模型,为今后研究肝脏发育,分化及肝癌预防、诊断及治疗等提供实验模型.方法:构建mir-122过表达载体,利用受精卵前核显微注射法将mir-122过表达载体导入小鼠受精卵中,获得mir-122过表达转基因小鼠.PCR法检测转基因小鼠的整合情况,实时定量PCR法检测mir-122过表达转基因小鼠肝脏及其主要器官mir-122及其确定靶基因高亲和性阳离子氨基酸转运体-1(CAT-1),切割同源物1(CUTL-1),血清反应因子(SRF)的表达情况.结果:mir-122过表达转基因小鼠,与同窝阴性鼠相比,mir-122在过表达转基因小鼠肝脏及主要器官中的表达升高,mir-122靶基因表达水平下降.结论:成功构建mir-122过表达转基因小鼠.     

APP/PS1双转基因小鼠鉴定及生物学功能研究

通过对APP/PS1双转基因小鼠尾部组织进行DNA提取,后续采用PCR扩增、琼脂凝胶电泳实验方法进行条带分析鉴定,比较蛋白酶K法和碱裂法对DNA提取差异,通过行为学实验、免疫荧光实验和Western blot检测小鼠病理产物的表达以验证APP/PS1双转基因小鼠生物学功能改变.结果显示,与蛋白酶K法相比,碱裂法提取的DNA浓度明显较高(P<0.001),纯度无显著性差异(P>0.05).水迷宫行为检测结果显示,定位航行实验中,与野生型比较,两组APP/PS1小鼠平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05,P<0.01,P<0.001),空间探索实验中,与野生型比较,两组APP/PS1小鼠穿越平台次数明显减少(P<0.05,P<0.01),目标象限停留时间明显缩短(P<0.01).Y迷宫实验结果显示,与野生型比较,两组APP/PS1转基因小鼠自发交替准确率明显降低(P<0.01).免疫荧光实验结果显示,与野生型小鼠比较,两组APP/PS1转基因小鼠脑部明显产生Aβ沉积(P<0.01,P<0.001).Western blot结果显示,与野生型比较,两组APP/PS1转基因小鼠海马组织Aβ表达量明显增多(P<0.05).以上结果表明,APP/PS1双转基因小鼠在8月龄出现明显Aβ沉积及行为学改变,在DNA提取方面,蛋白酶K法和碱裂法对APP/PS1双转基因小鼠的DNA提取均准确无差异,碱裂法具有简单高效的优点,在常用的定性鉴定方面具有优势.     

高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立

为解决因目的基因G-C(鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对)含量过高导致的目的基因扩增困难,以及操作过程中多环节引起的DNA污染导致的假阳性问题.本研究以突变型Foxo1(Forkhead转录因子1)转基因小鼠作为对象,就高G-C含量转基因的PCR方法和多个环节避免DNA污染进行了探索,结果显示,实验中消除了PCR的假阴性和假阳性现象,得到了准确的突变型Foxo1转基因小鼠的基因型鉴定结果.     

淫羊藿黄酮对APP转基因小鼠学习记忆及β-amyloid生成的影响

观察不同月龄APP(amyloid precursor protein)转基因模型小鼠学习记忆功能的改变,以及中药有效部位淫羊藿黄酮对10月龄转基因小鼠学习记忆功能和脑内APP、BACE的表达及β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)生成及含量的影响.用药组小鼠自4月龄开始灌胃给予淫羊藿黄酮小(0.03 g·kg-1/d)、大剂量(0.1 g·kg-1/d)6个月至10月龄,正常对照组、转基因阴性对照组及模型组以同样方式灌胃给予蒸馏水.应用Morris水迷宫和物体识别方法测试小鼠学习记忆能力,应用免疫组化学及Western Blot方法分别检测海马CA1区及皮层中APP、BACE的表达,采用双抗体夹心ELISA试剂盒测定海马中不溶性Aβ1-42含量.研究结果表明,APP转基因小鼠在4月龄即出现学习记忆能力障碍,在水迷宫实验中,比转基因阴性对照组小鼠潜伏期延长28%(p<0.05).增龄至10月龄,APP转基因小鼠学习记忆能力明显下降,水迷宫潜伏期及游泳距离与转基因阴性对照组的差异分别加大为40%(p<0.01)和35%(p<0.05),物体识别实验中分辨指数的差异为61%(p<0.05).与正常对照组及转基因阴性对照组相比,10月龄转基因模型小鼠海马CA1区及皮层中APP和BACE的表达明显增加,海马中Aβ1-42的含量明显升高.淫羊藿黄酮大剂量可明显改善10月龄APP转基因小鼠Morris水迷宫作业成绩,提高模型鼠物体识别能力,明显减少APP转基因模型小鼠海马和皮层APP及BACE的表达,降低海马Aβ1-42的含量.提示淫羊藿黄酮能改善APP转基因模型小鼠学习记忆能力和减少Aβ经由淀粉源途径生成及含量,对防治AD等神经退行性疾病具有良好的应用前景.     

βCaMKII蛋白修饰转基因小鼠工作记忆的研究

利用前额叶脑区过量表达β钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶II(βCaMKII)的蛋白修饰转基因小鼠,研究βCaMKII对小鼠工作记忆的影响.Western Blot结果显示,转基因小鼠前额叶脑区的βCaMKII过量表达.在修饰的水迷宫实验中,与对照组相比,转基因小鼠的逃避潜伏期没有发生明显变化.此外,在T迷宫实验中,转基因小鼠的正确率与对照组的正确率也基本相同.由此推测,βCaMKII的过量表达对于前额叶皮层依赖的工作记忆没有明显的影响.     

转基因小鼠与肿瘤研究

转基因小鼠的出现有力地推动了肿瘤研究的发展。具有癌症倾向的转基因小鼠,是从DNA水平开展有关人类恶性肿瘤发生、生长、转移和防治研究的良好活休模型。肿瘤形成与控制细胞生长和分化的多种基因特别是癌基因、抑癌基因的遗传改变有关。在利用转基因小鼠进行实验研究时,对由相同结构基因建立的不同转基因小鼠家系在癌基因表达上的时空差异性,应当给予足够的重视。此外,实现转基因动物生产的专业化、产业化,将会加速我国生命科学领域中转基因动物应用研究的进程。     

脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1转基因小鼠制备

目的制备脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1(Insulin-Like Growth Factors 1,IGF-1)转基因小鼠。方法采用精子为载体法进行基因转导,出生后小鼠PCR检测,建立转基因小鼠系,用Western blot和免疫荧光法分别检测转基因小鼠海马齿状回亚粒状区(subgranular zone,SGZ)IGF-1表达量和报告基因EGFP阳性细胞数。结果获得3只阳性小鼠,2只外源基因能稳定遗传,并建立了转基因小鼠系,转基因鼠SGZ区域IGF-1表达量显著高于正常鼠,EGFP也在此区域表达。结论成功制备IGF-1转基因小鼠。     

小鼠转基因及传代研究

综述了湖北省农科院生物技术研究所近年来有关转基因小鼠的主要研究进展。应用原核注射技术 ,将POMT PGH、hDAF、pBHSA、pSHSA、PT HBV 1 3、Bcl xL、hCD5 9、hCD5 9+hMCP等 8种外源基因 ,注入并移植 4 874枚小鼠的受精卵 ,得到 5 5 6只小鼠 ;经PCR和Southern杂交检测 ,确认原代转基因小鼠 10 8只。基因整合率平均 19.4 % ,转基因效率平均 2 .2 %。应用混合注射的方法得到了转双基因小鼠 ,双基因共整合率 2 2 .2 %。表达外源蛋白的转基因小鼠在 5 0 %～ 10 0 %之间。研究了小鼠的超数排卵和影响转基因效率的几个因素。通过转Bcl xL小鼠与非转基因小鼠连续五个世代的传代交配和检测 ,研究了转基因小鼠外源基因的遗传规律 ,表明四只原代小鼠中 ,只有一只能稳定地将外源基因传递给后代。并非所有的转基因小鼠都具有遗传的稳定性 ,欲建立小鼠的转基因品系 ,尚需对原代转基因小鼠进行筛选。     

Spexin转基因小鼠的构建及表型初步分析

Spexin是一种具有多种生物学功能的神经肽,在代谢疾病及神经系统疾病中发挥重要作用.为了深入研究spexin的生理功能和相关机制,构建了spexin转基因小鼠,通过检测血液中spexin含量以及糖耐受实验,对模型小鼠进行了初步的表型分析.利用piggyBac(PB)转座子技术培育spexin转基因小鼠,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分别在基因层面和蛋白层面验证了模型动物是否构建成功.之后用饲喂高脂饲料的雄性小鼠进行糖耐受实验,对转基因模型小鼠进行表型分析.PCR结果显示,以靶向spexin的两对引物扩增,转基因型小鼠基因组DNA中能分别扩增出300 bp和301 bp的片段,而野生型小鼠则不能.ELISA结果中,转基因型小鼠血清中spexin含量较野生型小鼠显著升高;同一表型中,雌雄小鼠间血清中spexin水平无明显差异.饲喂高脂饲料85 d内,转基因型小鼠和野生型小鼠体重变化未观察到显著差异;糖耐受结果显示,转基因型小鼠每个时间点血糖浓度均低于野生型小鼠,且在15 min时具有显著性差异.结果显示成功构建了过表达spexin基因的小鼠模型.spexin表达水平的升高在一定程度上提高了C57BL/6小鼠的糖耐受能力.该模型为进一步研究spexin基因在动物体内的功能以及在代谢疾病发病机制中的作用奠定了基础.