乳腺癌细胞靶向特异性多肽研究

通过噬菌体肽库技术, 研究能特异性结合并具有携带目的基因进入靶细胞能力的多肽. 以人乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞, 与pC89噬菌体肽库共培养筛选出能特异性进入靶细胞的小肽噬菌体. Subtilisin被用于灭活未进入细胞的噬菌体, 进入细胞的特异性小肽噬菌体经细胞裂解、转化E. coli XLI-Blue得到扩增. 经5轮反复共培养, 富集得到能特异性进入乳腺癌细胞的小肽噬菌体. 以RGD-integrin binding噬菌体为对照, 分别检测乳腺癌细胞特异性小肽噬菌体与MDA-MB-231、其他乳腺癌细胞株以及实体瘤细胞株的亲和性. 测序并合成无噬菌体外壳蛋白的特异性多肽(CASPSGALRSC)以标记FITC; 同时为了解氨基酸序列排列对特异性的影响, 合成了调整氨基酸序列排列次序的多肽(CGSLSRAPSAC), 并检测其与人乳腺癌细胞的特异性. 实验获得与MDA-MB-231细胞特异性结合的小肽噬菌体; 合成的无噬菌体外壳蛋白的多肽序列保持与MDA- MB-231细胞的特异性, 并且亲和性高于嵌合蛋白(RGD-integrin). 本研究建立了一种利用噬菌体肽库研究能结合或进入不同细胞的未知多肽的技术; 得到了一条能与MDA- MB-231高特异性结合的氨基酸多肽序列; 这种高特异性呈现氨基酸多肽序列高度依赖性; 该氨基酸多肽具有作为乳腺癌基因治疗高效靶向性载体的潜在临床应用价值.     

噬菌体基因工程抗体

噬菌体基因工程抗体(Phage Antibody)由于其筛选方式的优化及抗体产量的大大提高，使得基因工程抗体技术最终取代杂交瘤克隆抗体技术成为必然。本主要针对噬菌体抗体技术予以介绍。     

春化相关基因ver203F cDNA 3′末端的克隆及序列分析

以差异筛选技术克隆到的春化相关基因ｃＤＮＡ ｖｅｒｃ２０３为基础,设计５’端引物,利用ＲＡＣＥ克隆策略,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到ｃＤＮＡ的３‘末端序列ｖｅｒ２０３Ｆ（１１９７ｂｐ）,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明其全长约２．０ｋｂ,且其表达具有春化处理的特异性。检索表明该基因序列（ＡＢ０１２１０３）与一大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性,推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介质的信号传导途径。     

单克隆抗体制备的一种特异电融合方法研究

常规制备单克隆抗体(McAb),一般采用的都是非特异融合方法,这就导致(1)分泌特异性抗体的杂交瘤阳性率不高、筛选工作量大;(2)不易得到高亲和力的McAb。近年来,Lo等和Wojchowski等发展了生物素-抗生物素-抗体-抗原介导的特异电融合,克服了上述缺点。然而,该方法较繁琐,不宜推广应用。我们用双功能连接剂将抗原直接挂到骨髓瘤细     

《重组抗体》

重组抗体技术使制备人源化抗体和人源抗体成为可能，而这是其他常规的多克隆或单克隆抗体制备方法所不可能做到的．本书共分为22章，介绍了4个方面的技术：抗体库技术，包括组合抗体库、噬菌体抗体库、细菌和酵母展示的抗体库、核糖体展示的抗体库及其抗体库的筛选技术；重组抗体基因的改造和表达，包括抗体亲和力成熟、抗体人源化改造和稳定性改造，以及抗体基因在原核.     

水稻OsSH3P2短肽多克隆抗体的制备和鉴定

特异性抗体的成功制备是研究蛋白功能的重要环节,目前短肽抗体制备技术在动物中的应用日益成熟,然而该项技术在植物中的应用甚少.本研究通过分析水稻OsSH3P2蛋白的抗原表位、亲水性以及同源蛋白氨基酸序列,同时利用RoseTTAFold系统进行蛋白模型预测.选取了3条序列特异、亲水性高、具有抗原表位和不同肽链结构的氨基酸序列,通过人工合成短肽抗原、偶联KLH载体蛋白后,免疫新西兰大白兔制备得到相应多克隆抗体.经酶联免疫吸附测定检测获得了3份Anti-OsSH3P2-1#、Anti-OsSH3P2-2#、Anti-OsSH3P2-3#高效价短肽多克隆抗体血清.用免疫印迹(Western blotting)方法对OsSH3P2原核重组蛋白和植株内源的OsSH3P2蛋白进行检测,以进一步确定短肽抗体的特异性.结果显示,由不含α-螺旋和β-折叠结构的肽段作为抗原,免疫制得的Anti-OsSH3P2-1#短肽多克隆抗体能有效识别OsSH3P2蛋白,且不受同源蛋白干扰,说明该抗体具有较高的免疫特异性. OsSH3P2短肽多克隆抗体的成功制备,为进一步挖掘OsSH3P2生物学功能奠定基础,且为植物短肽抗体...     

结核分枝杆菌多价核酸疫苗的构建及免疫原性

将编码结核分枝杆菌MPT-64，Ag85B和ESAT-6分泌蛋白的结构基因或包括信号肽的全基因序列定向克隆到真核表达载体pJW4303中，转化到TOP10大肠杆菌，提取质粒DNA，经限制性核酸内切酶鉴定及序列分析证实含有正确的上述3种分泌蛋白的结构基因（包括信号肽）全序列，用脂质体介导法将重组表达质粒导入COS7细胞内并进行瞬时表达，收集表达细胞或浓缩上清液，12%或15%的SDS-PAGE电泳分离，用结核杆菌特异性抗体进行免疫印迹杂交，证明上述3种重组质粒能在哺乳动物细胞中表达出特异蛋白，3种重组表达质粒同时肌注免疫小鼠21d后，Ag85B抗体的平均滴度即达到1：3200，第2次免疫21d达到1：102400，MPT-64抗体的平均滴度在首免21d后为1：50，第2次免疫21d后为1：200，两次免疫21d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体，三免21d后Ag85B的特异性细胞因子γ-干扰素的浓度为110pg/mL；面MPT-64和ESAT-6的γ-干扰素浓度未检测到，实验在国内首次用结核杆菌多价DNA疫苗对小鼠进行了免疫实验，二免后的抗体水平已达到或超过国内外已报道的单价苗最高抗体水平，表明多价核酸疫苗和分泌型蛋白载体有利于增强疫苗的保护性应答。     

链间连接肽对单链双特异性抗体生物学活性的影响

单链双特异性抗体(scBsAb)是具有良好临床应用前景的基因工程抗体, 但不同的链间连接肽(interlinker)对其生物学活性的影响尚有待深入研究. 设计并合成3种不同的链间连接肽序列, 分别命名为Fc, HSA和205C′, 并构建成单链双特异性抗体通用表达载体, 以抗人CD3改形单链抗体(scFv)和抗人卵巢癌单链抗体为基础, 构建成单链双特异性抗体. SDS-PAGE及Western blot结果表明, 3种不同的链间连接肽对抗体的表达量无明显影响. 在此基础上, 进行ELISA及血液药代动力学测定, 发现不同链间连接肽的单链双特异性抗体与相应抗原的结合活性及其在小鼠体内的清除相T_1/2存在一定差异, 链间连接肽HSA可以显著延长抗体在体内的滞留时间. 上述研究结果提示, 链间连接肽序列将会影响单链双特异性抗体的抗原结合活性及其在体内的稳定性等重要的生物学特性. 因此, 筛选理想的链间连接肽序列对于构建单链双特异性抗体具有重要意义. 合适的链间连接肽可以赋予单链双特异性抗体更适于临床应用需求的生物学活性.     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨ＣＤ２分子的信号传递功能,以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈ４２１１－Ｇｌｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”,采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白ｃＤＮＡ序列,并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内ＣＤ２胞内区结合的特异性,克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胸内蛋白分子与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－ｌ）同源,Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体     

噬菌体及其宿主的基因组协同进化

据英国Nature，2007．449：83报道，美国科学家林德尔（D．Lindell）等人研究了噬菌体P—SSP7和其宿主海洋原绿球藻MED4在噬菌体感染过程中的全基因组表达，以期了解微生物寄生条件下基因组的协同进化。     

鮸状黄姑鱼养殖群体的遗传多样性

对鮸状黄姑鱼养殖个体不同组织提取的、不同纯度及不同浓度的DNA模板的RAPD扩增结果进行对照分析。在此基础上,应用20个随机引物对其群体的遗传多样性进行RAPD检测。结果表明:（i）该养殖群体平均多态性为15.32％,平均遗传差异度为0.0319,遗传多样性水平较低,但仍具有一定的变异潜力,尽快采取适当的管理保护措施,可以保持乃至提高鮸状黄姑鱼遗传多样性水平。（ii）从不同部位（鳍条、肌肉、性腺、血液）提取的DNA模板的扩增产物基本一致,由鳍条取样能确保实验用鱼继续存活。（iii）RAPD检测方法对DNA模板纯度要求不高,DNA模板浓度在一个较大范围内（0.05～50ng/μL）对扩增产物的重复性影响甚微。（iV）RAPD技术在鱼类种质资源的遗传多样性检测中是一种灵敏、有效和方便的技术方法。     

具有催化萘普生乙酯水解能力的多克隆抗体

80年代化学和免疫学领域中的一项重大发现——催化抗体(抗体酶),把抗体的极其多样性与酶的巨大催化能力等特性结合在一起,为传统的化学和免疫学研究开辟了一个崭新的方向.利用经过特殊设计并合成的有机分子作为半抗原,联接载体蛋白后免疫动物并经细胞杂交技术,从筛选和分离的单克隆抗体中,成功地获得具有催化功能的抗体.至今已有50多个反应能用催化抗体来催化,对某些反应(如Diels-Alder反应),自然界不存在能催化它们的酶,也能用抗体来催化进行.因此,设计具有特异性的催化抗体,在化学、生物学、医学等领域无疑将显示巨大的应用潜力.茶普生(1)是一种非常重要的非甾体消炎镇痛药,其S构型的药效为R构型的38倍,研究用抗体催化水解萘普生乙酯(2)来拆分获得S构型的萘普生,具有重要的理论意义和潜在的应用价值.本文简要报道具有催化萘普生乙酯水解能力的多克隆抗体的研究.     

红莲型细胞质雄性不育线粒体相关嵌合基因的发现

以水稻红莲型（HL）粤泰细胞质雄性不育系A和保持系B及杂种一代F1为研究材料，以在DNA和RNA水平均存在差异的atp6基因为探针，筛选A和B的线粒体基因组文库，找到了与红莲型细胞质雄性不育相关的嵌合基因orfH79。该基因位于atp6基因的下游，由coxI的部分编码序列以及一段未知来源的序列构成。PCR和Southern分析均证实了orfh79不育胞质线粒体的特异性。     

定向进化和噬菌体展示：生物方法开启化学新时代——2018年诺贝尔化学奖简介

进化是生命多样性形成的重要动力和基础。1993年,阿诺德首次引入酶定向进化技术,而该技术制备出的酶在生物燃料和药品制备等方面均得到广泛应用。1985年,史密斯首次实现在噬菌体表面表达外源蛋白的噬菌体展示技术;1990年,温特首次将噬菌体展示技术用于抗体制备。噬菌体展示技术制备的阿达木人单抗于2002年批准应用于多种免疫性疾病的治疗。因此,酶定向进化和抗体噬菌体展示已为人类带来巨大利益,并为将来的化学革命奠定了坚实基础。阿诺德、史密斯和温特三位科学家由于这些奠基性贡献而分享2018年诺贝尔化学奖。文章介绍这些技术的发明过程和广泛应用,同时回顾多位科学家的重要贡献。     

人抗体库技术

90年代兴起的人抗体库技术从广义上讲,应包括噬菌体人抗体库技术和人抗体转基因小鼠,由于该技术具有生产人抗体的潜力,因此,吸引了越来越多的科技工作者投入这一领域的研究,使得人抗体工程的研究在短短几年内发展极为迅速,已成为现代生命科学研究的热点之一,本文将着重介绍人抗体库技术的最新研究进展,并对其存在的问题及今后的研究热点进行了分析.     

小麦黄花叶病毒72ku蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备

采用逆转录－ＰＣＲ方法,扩增获得小麦黄花叶病毒（ＷＹＭＶ）ＲＮＡ２上的７２ｋｕ蛋白基因,将其克隆到ｐＥＴ３０ａ（＋）上,构建了该基因的原核表达载体ｐＥＴＰ７２。ＳＤＳ－ＲＡＧＥ分析结果显示,经ＩＰＴＧ诱导,７２ｋｕ蛋白基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中得到高效表达。以含表达产物的凝胶作为抗原,免疫家兔,首次制备了小麦黄花叶病毒ＲＮＡ２７２ｋｕ蛋白特异性抗血清。     

多表位-表位疫苗诱导多中和表位特异性的抗HIV-1抗体

针对HIV-1包膜蛋白的中和抗体在体外高度有效地抑制不同病毒株的侵染,但在体内只以很低水平存在,提出多中和表位-表位疫苗作为提高体内中和抗体水平及机体抗病毒变异能力的新战略,两种候选从中和表位-表位疫苗在猴体内能同时诱导出预先确定的多中和表位特异性的抗体,这些抗体能识别表位多肽、gp41多肽、V3loop多肽、rsgp41和gp120上相应的中和表位,此外,3个实验型表位疫苗的组合（另一种形式的多中和表位-表位疫苗）在兔体内也诱导出类似的免疫应答。上述实验结果表明：多中和表位-表位疫苗可能是一种能同时诱导多重抗病毒活性、抗HIV-1感染以及对付病毒变异的新战略。     

组合抗体库技术的研究进展

组合抗体库技术是现代免疫化学研究的重要方法。它可以在体外构建大容量、高多样性的文库,将基因型和表型整合在筛选系统中实现表型的可复制,最终利用生物进化原理进行高通量筛选。这一技术可以在体外重建免疫系统,使抗体的筛选不受动物或生物组织的限制;通过分子克隆,可记录供者完整的免疫信息;通过重链和轻链的随机重组,可以提高文库的多样性,规避免疫耐受,揭示罕见抗体谱。随着免疫化学研究的不断深入,组合抗体库技术也在不断改进,出现了新的筛选策略,如基于自分泌的筛选系统和基于细胞-细胞相互作用的筛选系统。文章介绍组合抗体库技术的研究进展。     

新发现的免疫应答调节分子:IgM抗体的Fc受体(TOSO/FAIM3)

抗体除了通过其Fab段结合抗原以外,还能通过其Fc段与Fc受体(Fc receptor,FcR)结合调节免疫应答.近几年来,伴随IgM FcR(FcμR)基因的发现,对IgM抗体功能的调节机制研究取得了重大突破.本文总结了近年来FcμR研究方面的最新进展,主要介绍了FcμR的结构及其与IgM结合的高度特异性;FcμR在IgM促进体液免疫应答和维护自身免疫耐受中的调节作用;IgM/IgG通过IgM/IgG受体自我调节体液免疫的机理;FcμR在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中过表达和CLL发生发展的关系.本综述将有助于理解体液免疫的调节机理,为研究免疫缺陷和自身免疫的发生原因提供新的思路.     

CD2胞内区结合蛋白的分子克隆与鉴定

为了探讨 ＣＤ２分子的信号传递功能，以编码ＣＤ２胞内区（Ｔｈｒ２１１－Ｇ１ｎ３３６）肽段的ｃＤＮＡ为“钓饵”，采用酵母双杂交系统从激活的人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中筛选与之相互作用蛋白的ｃＤＮＡ序列．并采用免疫共沉淀法鉴定该蛋白在体内与ＣＤ２胞内区结合的特异性．克隆并鉴定了一个与ＣＤ２胞内区特异性结合的胞内蛋白分子，与ｖ－ｆｏｓ转化效应蛋白（Ｆｔｅ－１）同源 Ｆｔｅ－１参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体转运蛋白质．蛋白数据库检索表明，Ｆｔｅ－１具有蛋白激酶ＰＫＣ的结合与作用位点，提示Ｆｔｅ－１参与ＣＤ２分子介导的信号传递