亚热带木腐真菌产漆酶及其酶学性质

对选育的一株木腐真菌Psathyrella candolleana进行液体深层发酵生产漆酶,通过硫酸铵盐析和离子交换色谱等纯化技术分离发酵酶液后,得到纯度较高的漆酶,并对其酶学性质进行研究.结果表明:P.candolleana在发酵罐中的漆酶产量最高可达9 100 U/L;分离纯化后得到漆酶活性组分,其比活力达到438...     

磷酸二酯酶4B专一性抑制剂设计中的构象分析（英文）

为研究磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂Y3、Y8及A33的结构与活性之间的关系,寻找Y3和Y8抑制活性偏低的原因.采用分子对接、构象搜索、量子力学计算、分子动力学以及分子力学-广义波恩及表面积连续介质模型进行了计算.结果表明：Y3、Y8及A33与PDE4亚型PDE4B和PDE4D的结合模式类似,亲和能相近.但Y3与Y8与PDE4B/PDE4D的结合构象以及A33与PDE4D的结合构象均为高能构象,而A33与PDE4B的结合构象为低能构象.故结合构象内能过高是这些配体抑制活性降低的主要原因,构象分析对药物分子设计至关重要.     

纤维微菌海藻糖合成酶基因克隆表达及酶学特性鉴定

【目的】开发适用于海藻糖生产的新型海藻糖合成酶。【方法】通过反向PCR技术,从一株纤维微菌的基因组DNA中获知海藻糖合成酶基因完整ORF序列,进而克隆得到纤维微菌海藻糖合成酶基因(CCTreS),将其与表达载体pSE380构建重组质粒后转入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,通过镍柱亲和层析纯化得到纯酶并进行酶学性质测定。【结果】从纤维微菌中克隆并在大肠杆菌中成功表达海藻糖合成酶基因(CCTreS)。经纯化获得的重组酶(CCTreS)在以麦芽糖为底物生成海藻糖时,最适反应pH值为7.0,最适反应温度为45℃,40℃保温1h仍具有80%以上的相对酶活力,在pH值5.5~8.5保存24h,相对酶活力仍保留80%以上。Cu~(2+)对其有明显抑制作用。【结论】该重组酶具有很好的热稳定性和pH稳定性,具有一定的研究价值和潜在的工业应用价值。     

产碱假单胞菌碱性脂肪酶的克隆表达及酶学性质

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定,并扩增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侣基因。以pET-22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。通过PCR成功克隆到该菌的脂肪酶基因(lipPA-9A)和脂肪酶分子伴侣基因(lipPA-9B),并构建共表达重组质粒pET22b-lipPA-9A-9B,实现脂肪酶LIP-9A的活性表达。酶学性质研究表明LIP-9A的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为10.5,最适反应底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNPO);同时,LIP-9A还可以催化醇和羧酸发生酯化反应产生酯类物质。【结论】LIP-9A在碱性条件下具有较高活力,且可以催化酯化反应,在洗涤行业和酯合成领域具有一定的应用价值。     

新型核苷碱基卤化酶AcmX的原核表达和结晶实验

在链霉菌中发现了一类能对核苷碱基进行特异位点卤化修饰的新型卤化酶,可用于核苷类药物的卤代优化。对新型核苷碱基卤化酶晶体结构的解析,是阐明其生物催化的机理,建立生物催化卤化制备核苷类药物的最直接手段。为了获得一个卤化酶AcmX的晶体结构,首先通过大肠杆菌原核表达制备AcmX蛋白样品,但只能得到没有活性的AcmX的蛋白包涵体。通过构建AcmX、分子伴侣蛋白共表达系统,注意控制合适的分子伴侣蛋白表达水平,并通过高分辨率的分子筛凝胶层析步骤,去除混入AcmX样品的分子伴侣蛋白GroEL,摸索出表达和纯化高质量AcmX蛋白样品的方法,并将蛋白样品成功用于结晶实验。这不仅为解析卤化酶AcmX的晶体结构打下坚实的基础,还可将本研究的方法用于其他表达困难的蛋白的制备。     

真核表达肝药酶UGT1A9可溶重组蛋白方法探索

UDP-葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)是人体重要的肝脏药物代谢酶,其底物选择性、催化机制等研究因难以获得可溶性全酶而受到限制.本研究以制备UGT1A9可溶重组蛋白为研究目标,通过筛选重组蛋白表达体系、融合标签种类及linker长度,优化重组蛋白表达纯化条件和方法,实现了重组UGT1A9的大量制备.HEK293F细胞分泌表达的His₈-MBP-NSAS-UGT1A9(氨基酸25-466)重组蛋白经Ni-TED亲和纯化介质从培养基上清液中分离,洗脱产物经SDS-PAGE、Western blot及MS检测鉴定为目的蛋白,通过Bradford法测得重组蛋白最终产量为2 mg/L,纯度达到95%以上.本研究建立了一种人源药物代谢酶UGT1A9的可溶重组蛋白表达纯化方法,为UGT1A9及UGTs同工酶的药物代谢、催化机制及结构解析研究奠定基础.     

枇杷核醇腈酶的高效分离纯化及酶学性质研究

以枇杷"解放钟"的核为原料,根据醇腈酶高耐热性的特点,采用60℃热处理-DEAE-Sepharose FF柱分离组合技术,从枇杷核中获得电泳纯的醇腈酶.最终纯化酶的比活力达到232 U·mg-1,酶活力回收率高达64%.所制备的的R型醇腈酶具有高度的光学选择性,催化苯甲醛与丙酮氰醇反应产生R型扁桃腈,对映体过量值达到9...     

动物脑组织中钙调蛋白的分离纯化

本文主要以动物脑组织为材料,经热变性、离心、葡聚糖SephadexG-50分离纯化,通过紫外吸收图谱、二步酶解法检验钙调蛋白的纯度、浓度。结果显示,利用本法可分离纯化得到的钙调蛋白对PDE的激活倍数为83.3,比标准的钙调蛋白(对PDE的激活倍数为67.4)更具生物活性.     

酶解-超声法破碎大肠杆菌提纯包含体

大肠杆菌的破碎方法对包含体的纯度有较大影响.采用酶解和超声波相结合的方式进行了大肠杆菌的破碎实验研究,考察了溶菌酶用量、酶解温度、超声处理功率和时间等因素对菌体破碎程度的影响,通过测定破碎液的A650,A280,A260 nm来反映细胞的破碎程度和胞内蛋白及核酸物质的释放情况.在优化的条件下,每克湿菌体添加2 mg溶菌酶,30 ℃酶解60 min、500 W超声破碎50次后,经分离洗涤可获得纯度达57%的包含体.本方法可获得纯度更高的包含体,利于重组蛋白的进一步纯化.     

产热稳定α-半乳糖苷酶菌株的筛选及酶活力的初步研究

利用选择性培养基从发霉的豆粕、豆油工厂周围环境中取样并分离纯化获得一株产热稳定性α-半乳糖苷酶耐热真菌,通过形态学和分子生物学鉴定方法初步鉴定该菌株为分枝犁头霉.研究表明该菌株生长的最适温度和pH值是47℃和7.0,所产酶为胞内酶.酶活研究表明粗酶液的最适温度和pH值分别为68℃和7.0,具有较好的热稳定性.     

研究生分子生物学综合实验设计──IMPACT蛋白单柱亲和纯化

设计了一个研究生分子生物学综合实验,利用内含肽介导的IMPACT系统对蛋白质进行纯化。将目的基因构建入pTWIN2载体,转化至大肠杆菌ER 2566中诱导其表达,进化亲和层析,检测其表达情况。该方法具备比以往亲和层析纯化方法更加经济的特点,可提高目的蛋白表达的成功率。通过本实验使学生掌握的分子生物学研究中最新的蛋白质分离纯化操作技术,为进一步学习和掌握复杂、综合性的分子生物学技术打下扎实的基础。     

Structural determinants for regulation of phosphodiesterase by a G protein at 2.0 A

A multitude of heptahelical receptors use heterotrimeric G proteins to transduce signals to specific effector target molecules. The G protein transducin, Gt, couples photon-activated rhodopsin with the effector cyclic GMP phosophodiesterase (PDE) in the vertebrate phototransduction cascade. The interactions of the Gt alpha-subunit (alpha(t)) with the inhibitory PDE gamma-subunit (PDEgamma) are central to effector activation, and also enhance visual recovery in cooperation with the GTPase-activating protein regulator of G-protein signalling (RGS)-9 (refs 1-3). Here we describe the crystal structure at 2.0 A of rod transducin alpha x GDP x AlF4- in complex with the effector molecule PDEgamma and the GTPase-activating protein RGS9. In addition, we present the independently solved crystal structures of the RGS9 RGS domain both alone and in complex with alpha(t/i1) x GDP x AlF4-. These structures reveal insights into effector activation, synergistic GTPase acceleration, RGS9 specificity and RGS activity. Effector binding to a nucleotide-dependent site on alpha(t) sequesters PDEgamma residues implicated in PDE inhibition, and potentiates recruitment of RGS9 for hydrolytic transition state stabilization and concomitant signal termination.     

光谱分析用于无创血糖检测的微量葡萄糖测量

采用无创伤的方法检测血糖是人们长期以来追求的目标,是当今国际医疗和传感器领域十分关注的课题之一.无创血糖检测将使糖尿病检测手段产生质的飞跃,对糖尿病的治疗具有重要的实际意义.唾液中葡萄糖含量仅为血液中葡萄糖含量的1 50～1 100,所以通过人的唾液测量血糖值,其精度要达到0.01mmol L.基于光谱分析技术,实现了葡萄糖的微量检测,精度高,重复性好.为实现无创血糖检测奠定了良好的基础.     

新型仿生亲和介质纯化工艺生产效率分析

抗体的捕获层析的成本在整个抗体纯化工艺中占有相当的比例.分析比较了新型小分子仿生亲和介质和常规蛋白A的动态载量、循环使用次数和线性流速等参数,并计算了相应的生产效率,发现新型小分子仿生亲和介质最高生产效率能达到蛋白A亲和层析介质最高生产效率的3⁶.9倍.     

一种自剪切内含肽重组酿酒酵母表达优化研究

自剪切内含肽纯化系统在大肠杆菌中已经得到很好的应用。为了在真核生物中应用该系统,以酿酒酵母为宿主,p HR质粒为表达载体,构建微型内含肽ΔI-CM intein酿酒酵母表达系统。以猪免疫球蛋白Ig G的Fc domain为亲和标签,绿色荧光蛋白gfp为报告蛋白,在酿酒酵母GPD强启动子作用下,表达出融合的Fc-intein-gfp蛋白。检测发现融合序列在起始密码子ATG前加入一段Kozak序列有利于gfp表达。在此基础上,将微型内含肽ΔI-CM intein序列替换成密码子优化的ΔI-CMintein-O序列,显著促进gfp蛋白的表达量,初步实现了ΔI-CM intein融合蛋白的高效表达。为新型自剪切内含肽酿酒酵母表达系统的建立和重组蛋白高效纯化的实现奠定了基础。     

型腔高速螺旋刀路轨迹规划算法

针对现有型腔铣加工刀路规划方法难以满足高速切削的问题,提出了一种基于椭圆形偏微分方程的刀路规划算法.首先,由二维稳态下的温度平衡方程导出偏微分方程,将型腔边界偏置一个刀具半径,作为偏微分方程的边界,并将边界条件赋为0,以此建立刀路规划模型.然后,对边界内部的区域进行均匀离散,利用Delaunay算法构建三角网格单元,利用有限元法求解椭圆形偏微分方程,由偏微分方程的解构建等距线.最后,由等距线生成螺旋铣刀路,并对螺旋刀路进行了加工验证.实验结果表明,采用所提出的方法获得的螺旋铣刀路明显改善了机床的运动性能,提高了加工效率.     

人表皮生长因子融合蛋白在大肠杆菌表达的研究

在大肠杆菌中高效表达人表皮生长因子(hEGF)。根据大肠杆菌对密码的偏爱性,构建高效表达EGF融合蛋白的菌株,经离子交换层析和凝胶过滤层析两个步骤使产物得到纯化。融合蛋白表达产量为27%,EGF融合蛋白纯化产物纯度为95%以上,促3T3细胞增殖的活性测定为ED50为4.2ng/mL。在pET 3c:BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中,以融合蛋白方式表达人表皮生长因子,表达效率高,纯化路线简单,产量较高,适合产业化生产。     

巴马小型猪1 型糖尿病模型的建立

摘要: 目的建立链脲佐菌素( streptozotocin,STZ) 诱导巴马小型猪糖尿病模型。方法10 头小型猪随机分3 组,设为对照组( 2 头) 、实验1 组( 2 头) 和实验2 组( 6 头) ,分别静脉注射生理盐水、120 mg /kg 的STZ 和150 mg /kg 的STZ。在应用STZ 后24h 内,每小时检测一次血糖,此后每天一次,1个月后处死动物,取胰腺做病理学检查。结果120 mg /kg 的STZ 可引起一过性糖尿病,血糖在17 d 后逐渐恢复。150 mg /kg 的STZ,引发3 /6 头小型猪严重的糖尿病,血糖维持在16. 1 ～ 35. 0 mmol /L 之间,不能自发恢复; 2 /3 头小型猪呈一过性高血糖,类似应用120 mg /kg 的STZ 组动物的变化; 此外,还有1 /6 头动物未发生明显的高血糖。结论巴马小型猪一次性静注120 mg /kg 的STZ可引起一过性糖尿病, 150 mg /kg 的STZ 可引起严重的糖尿病,动物对STZ 的反应个体差异很大。     

玉米PDE191基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

为研究玉米白化相关基因PDE191序列信息和基因功能,以玉米叶片总RNA逆转录后的c DNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出玉米PDE191基因全长c DNA。DNA测序及生物信息学分析表明,玉米PDE191基因c DNA全长1229 bp,编码333个氨基酸的蛋白质,亚细胞定位于线粒体和叶绿体。软件预测PDE191蛋白分子量为37.79 k D,理论等电点为9.12,该蛋白二级结构主要构成元件为?螺旋和无规则卷曲,包含7个MTERF结构域。三级结构预测显示该蛋白为球状结构,预测结果与二级结构预测的结果相符。对该蛋白进行多重序列比对和聚类分析显示,PDE191属于植物MTERF家族,在不同植物中存在其同源蛋白质,其中与拟南芥PDE191氨基酸序列的相似性高达99%。本研究为进一步研究玉米PDE191基因的功能奠定了基础。     

新型葡萄糖氧化酶电极与毛细管电泳的联用

采用浸涂法将1－二茂铁基乙胺和壳聚糖修饰到铂电极表面，与葡萄糖氧化酶溶液作用后用戊二醛交联，制备壳聚糖固定化葡萄糖化酶生物传感器，测定葡萄糖在传感器上的伏安曲，采用恒电位安培检测法，葡萄糖浓度在0.002-4.0mmol/L范围内与响应电流成线性关系，响应时间短，由于二茂铁衍生物和葡萄糖氧化酶通过包埋，键合等作用固定于壳聚糖膜,中不易从电极表面流失，电极稳定性较好，同时尝试将该电有与毛细管电泳联用，成功用于人血清中葡萄糖的测定。