脐血单个核细胞和CD34+细胞体外扩增造血干/祖细胞

考察了脐血单个核细胞(MNC)和CD34+富集细胞在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性.实验发现CD34+富集细胞具有很高的扩增潜力,通过3周培养总细胞扩增了(883.2±322.4)倍,而MNC仅扩增了(53.3±6.2)倍.对比细胞集落生成和CD34+细胞的扩增发现,MNC的集落密度由最初的(270.9±54.9)CFCs/105cells上升至第7天的(1 496.3±417.7)CFCs/105cells,CD34+细胞百分比则由最初的(0.99±0.18)%上升至第7天的(4.4±1.9)%,而CD34+富集细胞在培养过程中,虽然集落总数和CD34+细胞总数始终呈上升趋势,但是其集落密度和CD34+细胞百分比则始终呈下降趋势.在两种起始细胞培养中,CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)在集落中的含量逐渐增加,BFU-E(爆式红细胞集落形成单位)含量则逐渐降低.在3周的短期培养中,MNC可以得到更多的集落形成细胞(CFC)和CD34+细胞.     

脐血造血细胞体外维持和扩增的实验研究

探讨胎儿、儿童、成人骨髓基质细胞对脐血造血细胞体外长期生存的维持能力,以及细胞因子组合在基质接触和无基质的培养体系中扩增脐血干、祖细胞的效应。将连续二次Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离的脐血单个核细胞（ＭＮＣｓ）接种至经辐照预处理的各种骨髓基质细胞上,持续培养６周,定期检测祖细胞（ＣＦＣ）和长期培养起始细胞（ＬＴＣ－ＩＣ）;使用干细胞因子（ＳＣＦ）、白细胞介素（ＩＬ）－３,ＩＬ－６组合,在基质接触     

从脐血单个核细胞诱导树突状细胞

探讨了从脐血单个核细胞定向诱导 DC的方法以进一步研究树突状细胞的功能与特性。从脐血中获取单个核细胞 ,在培养液中加入 GM- CSF、TNF- α、IL- 3、IL- 4,培养 1 4d后流式细胞仪分析细胞表面标志 CD1 a;培养末期加入 LPS,流式细胞仪分析细胞表面标志 CD83及 HLA- DR。发现用 GM- CSF+TNF-α+IL - 4可获得 ( 3 6 .79± 3 .1 5 ) % CD1 a+ 细胞 ,LPS可使 CD83及 HLA- DR的比例从 ( 0 .5 7± 0 .5 6 ) %及 ( 40 .2 7± 6 .3 3 ) %分别升至 ( 3 2 .79± 1 2 .90 ) %及 ( 95 .5 2± 3 .45 ) %。实验证明脐血单个核细胞作为另一种主要来源 ,经特定细胞因子诱导可生成大量 DC,并能通过 LPS刺激 DC成熟     

SCF和IL—3对脐血造血细胞长期液体培养的影响

考察了干细胞因子（ＳＣＦ）和白介素３（ＩＬ－３）的不同浓度（５～１００ｍｇ／Ｌ）组合对不同接种密度（分别为３×１０５、６×１０５、１０×１０５ｃｅｌｓ／ｍＬ）的脐血（ＣＢ）细胞扩增和分化的影响。在５种组合下,ＣＦＵ－ＧＭ的扩增倍数都是在ＣＢ单个核细胞培养１２ｄ后达到最高（（１６．４３±２．０８）～（３７．０２±４．６９）,平均为（２５．７５±３．２６））,各组合之间相差较小;而细胞总数的扩增倍数在培养２４ｄ后达到最高（（１４．３８±２．７２）～（３５５．２６±３５．５３）倍,平均为（１０３．４５±３８．７５））,各组合之间相差很大。结果表明,在静态细胞培养过程中细胞密度较高,不利于ＣＦＵ－ＧＭ和总细胞的扩增,如保持在较低细胞密度有利于总细胞数的扩增;细胞因子的浓度对ＣＦＵ－ＧＭ的峰值影响不大,但低浓度能使总细胞数的扩增明显减少。     

从脐血单个核细胞定向诱导巨核细胞的生成

采用 SCF、TPO、IL- 3、IL- 6、IL- 1细胞因子 ,从脐血单个核细胞定向诱导巨核细胞的形成。比较了 SCF+ TPO+ IL- 1、SCF+ TPO+ IL- 3、SCF+ TPO+ IL- 63种细胞因子组合对刺激巨核细胞生成的作用 ,经体外培养 8d后 ,CD41 + 细胞占培养物的比例分别达到 ( 5 .64± 0 .77) %、( 5 .73± 1 .2 4 ) %和 ( 2 0 .1± 2 .5 3) % ;每 1 0 4个细胞可形成巨核祖细胞集落形成单位 ( CFU- MK)为( 1 3.7± 5 .7)个、( 1 5 .0± 3.6)个和 ( 93.7± 1 6.0 )个。在 SCF+ TPO+ IL- 6体系中增加 IL- 6的浓度 ,可提高培养液中 CD41 + 细胞的纯度。当 IL- 6的浓度从 1 0μg/L增加到 5 0μg/L时 ,CD41 + 细胞的比例可从 ( 2 0 .1± 2 .5 3) %提高到 ( 2 6.81± 3.2 0 ) % ,但每 1 0 4个细胞形成 CFU- MK数目却从( 93.7± 1 6.0 )个减少到 ( 4 5± 8.6)个 ;这说明 IL- 6对巨核细胞的刺激主要作用在其发育的后期。采用 SCF+ TPO+ IL- 3+ IL - 6细胞因子组合 ,由 1× 1 0 6个单个核细胞培养一周后可诱导出 ( 1 .61±0 .5 8)× 1 0 5个 CD41 + 细胞 ,占培养物的比例可达到 ( 1 8.8± 1 .64) % ,每 1 0 4个细胞形成 CFU- MK数目可达到 ( 1 2 1 .8± 1 0 .3)个。这一结果为进一步体外大量扩增巨核细胞提供了基础     

人脐血造血干细胞在转瓶中的悬浮培养

考察经分离纯化后的人脐血CD34+富集细胞在转瓶中的扩增特性,细胞因子为SCF+IL-3+IL-6。实验发现,无论24孔板静态培养还是转瓶悬浮培养,孔板和转瓶内总细胞数分别扩增了(658.7±98.0)倍和(107.3±15.0)倍,说明CD34+具有很大的扩增潜能。对比两种培养体系下细胞集落扩增倍数发现,培养初期孔板内的集落形成能力要大于转瓶,但到培养后期,孔板内集落形成能力下降速度远大于转瓶。孔板中的CFU-GM(粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)扩增倍数在第14天为(5.6±0.4)倍,第21天为(1.7±0.5)倍,转瓶中在第14天为(2.1±0.7)倍,第21天为(1.8±0.5)倍。对比两者的CD34+扩增情况,孔板在第14天CD34+含量达到最大值,而到第21天则大大降低,而转瓶内CD34+含量仍可保持在原第14天的水平,转瓶内的CD34+细胞的扩增也比孔板保持较长时间。     

微囊化基质细胞对脐带血造血干/祖细胞扩增支持

将脐带血单个核细胞与包埋有兔骨髓间充质干细胞的海藻酸钙微胶珠在3种不同的培养液中进行了7d的体外静态共培养.每24h进行总有核细胞计数,在0、72和168h进行流式CD34+细胞分析以及甲基纤维素集落检验.实验结果表明:经过7d的静态共培养,在添加常规剂量造血生长因子的培养液中,总有核细胞扩增了(15±2.85)倍,CD34+细胞扩增了(5.33±0.32)倍,CFU-Cs扩增了(5.6±1.21)倍.微胶囊可以作为一种新的共培养隔离手段,微囊化兔骨髓间充质干细胞在添加适量血清或者造血生长因子组合的条件下对于脐带血造血干/祖细胞在静态下的扩增有明显的促进作用.     

GM-CSF体外促进多倍体巨核细胞的生成

在TPO IL-3的细胞因子组合中添加不同浓度GM-CSF，从脐血CD34^ 细胞定向诱导巨核细胞的形成，以此考察GM-CSF对巨核细胞体外扩增和成熟的作用。比较了TPO IL-3、TPO IL-3 GM-CSF(5、20、100μg／L)的4种细胞因子组合对巨核细胞扩增及形成多倍体的作用。结果发现：在TPO IL-3的细胞因子组合中添加GM-CSF有利于总细胞的扩增，对巨核细胞的纯度没有显著的影响。体外培养14d后，培养物巨核细胞中多倍体(≥8N)巨核细胞比例明显提高，从中可以看出GM-CSF能促进巨核细胞多倍体的形成。     

脐血干/祖细胞分离、冷冻和复苏技术

胎儿脐血作为富含ＣＤ３４＋细胞等造血干／祖细胞一个新来源,具有细胞增殖速度快,来源充足,收集安全等特点;脐血移植同样具有安全性好,效率高,费用低等优点。随着脐血干细胞移植临床应用的成功,欧美许多发达国家已经着手建立大规模脐血库以满足临床需求。建立脐血库技术上要求改善细胞冷冻保护剂组成,控制降温速率和细胞复苏方法,以获得理想的脐血干／祖细胞收率。同时由于脐血库液氮保存设备费用昂贵,需要预先分离脐血单个核细胞以减少样本冻存体积,以满足建库实际需求。     

一种高倍扩增细胞因子诱导杀伤细胞方法

CD3单克隆抗体分别以包被和悬浮的方式刺激人外周血单个核细胞,并以不同的基本培养基(RPMI-1640、IMDM、DMEM/F-12 (1:1)和M199)以及抗氧化剂(2-巯基乙醇和亚硒酸钠)培养细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞,分别测定细胞的扩增、表型(CD3CD56和CD25)和非MHC-限制性毒性(NK 毒性和LAK毒性).结果显示高浓度CD3单克隆抗体包被刺激方式的细胞集落和细胞扩增倍数大于悬浮刺激方式.基本培养基DMEM/F-12 (1:1)的扩增倍数优于其他3种基本培养基.抗氧化剂2-巯基乙醇和亚硒酸钠均有促进CD25抗原形成的作用,亚硒酸钠能提高CIK细胞的毒性,而2-巯基乙醇对于细胞的扩增有促进作用.建立了一种高倍扩增CIK细胞的方法,20 d细胞平均扩增倍数可以达到千倍以上.     

干细胞研究进展

由于干细胞具有自我更新和多向分化潜能的功能,使得人们用干细胞治疗多种疾病成为可能.就干细胞的研究概况、研究技术、干细胞技术的市场前景以及干细胞研究面临的问题等作一概述.     

干细胞及其应用

干细胞是当今细胞生物学乃至整个生命科学的主要热点之一，从干细胞的概念、生物学特性、分类等方面对干细胞进行了阐述，同时也对干细胞在移植治疗、克隆技术及转基因技术等方面的应用作了综述。     

Induction of embryonic stem cells to hematopoietic cells in vitro

In order to get hematopoietic cells from embryonic stem (ES) cells and to study development mechanisms of hematopoietic cells, the method of inducing embryonic stem cells to hematopoietic cells was explored by differenciating mouse ES cells and human embryonic cells in three stages. The differentiated cells were identified by flow cytometry, immunohistochemistry and Wright's staining. The results showed that embryoid bodies (EBs) could form when ES cells were cultured in the medium with 2-mercaptoethanol (2-ME). However, cytokines, such as stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO), interleukin-3 (IL-3), interleukin-6 (IL-6), erythropoietin (EPO) and granular colony stimulating factor (G-CSF), were not helpful for forming EBs. SCF, TPO and embryonic cell conditional medium were useful for the differentiation of mouse EBs to hematopoietic progenitors. Eighty-six percent of these cells were CD34+ after 6-d culture. Hematopoietic progenitors differentiated to B lymphocytes when they were cocultured with primary bone marrow stroma cells in the DMEM medium with SCF and IL-6. 14 d later, most of the cells were CD34-CD38+. Wright's staining and immunohistochemistry showed that 80% of these cells were plasma-like morphologically and immunoglubolin positive. The study of hematopoietic cells from human embryonic cells showed that human embryonic cell differentiation was very similar to that of mouse ES cells. They could form EBs in the first stage and the CD34 positive cells account for about 48.5% in the second stage.     

Induction of embryonic stem cells to hematopoietic cellsin vitro

In order to get hematopoietic cells from embryonic stem (ES) cells and to study development mechanisms of hematopoietic cells, the method of inducing embryonic stem cells to hematopoietic cells was explored by differenciating mouse ES cells and human embryonic cells in three stages. The differentiated cells were identified by flow cytometry, immunohistochemistry and Wright’s staining. The results showed that embryoid bodies (EBs) could form when ES cells were cultured in the medium with 2-mercaptoethanol (2-ME). However, cytokines, such as stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO), interleukin-3 (IL-3), interleukin-6 (IL-6), erythropoietin (EPO) and granular colony stimulating factor (G-CSF), were not helpful for forming EBs. SCF, TPO and embryonic cell conditional medium were useful for the differentiation of mouse EBs to hematopoietic progenitors. Eighty-six percent of these cells were CD34⁺ after 6-d culture. Hematopoietic progenitors differentiated to B lymphocytes when they were cocultured with primary bone marrow stroma cells in the DMEM medium with SCF and IL-6. 14 d later, most of the cells were CD34^－CD38⁺. Wright’s staining and immunohistochemistry showed that 80% of these cells were plasma-like morphologically and immunoglubolin positive. The study of hematopoietic cells from human embryonic cells showed that human embryonic cell differentiation was very similar to that of mouse ES cells. They could form EBs in the first stage and the CD34 positive cells account for about 48.5% in the second stage.     

用于“治疗性克隆”人胚胎干细胞研究面临的问题与可能的解决办法

利用培育的干细胞(SC)来实现组织再生和器官修复对于许多重大疾病如糖尿病、心脏疾病、老年性痴呆(AD)、帕金森病(PD)、神经损伤等的治疗具有重要意义,同时也是新药研发的重要工具.使用体细胞核转移技术(SCNT)克隆人类早期胚胎和提取干细胞,即所谓的"治疗性克隆"(Therapeutic cloning)技术,是目前进行干细胞个性化治疗的重要手段,具有广泛的临床应用前景.通过这种方法获得人胚胎干细胞的研究尚处于基础阶段,仍面临着许多有待解决的科学问题和技术挑战.在此主要就用于"治疗性克隆"人胚胎干细胞的研究进展做了简要综述,着重探讨了在该研究领域面临的主要困难,特别是在获得人成熟卵细胞方面,并提出了可能的解决办法.     

A microenvironment,rather than chemical,initiates the cardiomyogenic differentiation of marrow stromal cells

To investigate the potential of cardiomyogenic differentiation of rat hone marrow stromal cells (MSCs), they were exposed to 5-azacytidine treatments (single/repeat) at varying concentrations (3, 5, 10μmol/L) and the fates of the cells were analyzed by immunocytochemistry, Western blot and the reporter gene of enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of ventricular myosin light chain 2 (MLC2v) promoter. MSCs were also cocultured with cardiomyocytes for periods up to 16 days, and the expression of cardiac myosin heavy chain(MHC) and troponin Ⅰ (Tn I) proteins was analyzed. After the induction with 5-azacytidine, neither spontaneously beating ceils nor myotubes were found; MHC and Tn I proteins were also undetectable and no ECFP-positive MSCs were detected. But when cocultured with cardiomyocytes, spontaneously contracting MSCs were observed and cardiac specific proteins could be detected. The results proved that the novel effects of 5-azacytldine on the cardiomyogenic differentiation of MSCs should be questioned and a direct intercellular communication with cardiomyocytes is necessary for MSCs to differentiate into cardiomyocytes.     

干细胞工程的应用前景研究

近些年来干细胞的应用研究几乎涉及到所有生命科学和生物医学研究领域．由于干细胞能够自我更新和多向分化的生物学特性，使得干细胞工程在细胞的分化和胚胎发育、转基因动物和动物克隆、新型高效药物的开发和临床细胞治疗、组织工程等方面的研究中等有着广泛的应用前景，同时，作为一门新兴学科也面临着许多挑战．     

间质干细胞来源、鉴定、可塑性和应用前景(综述)

间质干细胞(MSCs)存在于骨髓、肌肉、骨、软骨等部位，可分化为中胚层的细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞等，亦可分化为内胚层、外胚层的细胞，如神经细胞、肝脏细胞、肾脏细胞等，同时由于来源广、易于分离扩增和基因转染，在临床、科研上有很大的潜在应用价值。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化研究进展(综述)

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)在体外分化培养条件下可以分化出各种组织细胞，其中包括心肌细胞。ES细胞在体外向心肌细胞分化与体内完整胚胎心肌发育过程相符合。该细胞在体外分化过程中顺序表达心肌细胞特有结构蛋白和离子通道，如肌球蛋白轻链和重链、特异性肌动蛋白、电压依赖性Ca^2 通道、K^ 通道等。ES细胞分化来源的心肌细胞具有体内心肌细胞的生理学特点，如产生的动作电位、表现自发性收缩等。因此，ES细胞是研究心肌细胞发育分化机制及鉴定其关键基因的理想模型。     

中国干细胞研究的现状、挑战和机遇

干细胞研究是过去十年中生物医学研究中最为热门的领域之一。我国的干细胞研究取得了很大的进步,同时也遇到不少问题。本文回顾了过去几年中我国干细胞研究的发展情况,从科研投入、硬件建设、人才队伍、科研成果、公共资源、法律法规、伦理准则、知识产权等多个方面,对我国干细胞研究的现状、面临的机遇和挑战进行了思考和分析,旨在对我们的工作有一个清醒的认识,以便能更好地部署我们下一步的工作。