利用报告基因表达系统快速鉴定骨诱导活性材料

通过构建真核表达质粒,使增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)报告基因的表达受骨形成相关转录因子Cbfa1基因启动子的调控,再用该质粒转染大鼠成肌细胞L6,建立稳定细胞株.在成骨培养基中诱导培养后,该细胞株呈现较明显的绿色荧光,表明细胞在经诱导的成骨分化过程中,Cbfa1基因表达增强,Cbfa1启动子驱动了EGFP的表达.将该细胞株接种到有较强骨诱导活性的羟基磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatitetricalcium phospha     

建立标准化SEAP报告基因系统的研究

通过建立SEAP(分泌性碱性磷酸酶)产物的标准曲线,得出SEAP的吸光值与酶活力、蛋白质绝对值之间相互换算的公式,从酶动力常数、酶反应时间、不同量mRNA与酶吸光值之间的对应关系等方面进行研究.建立了在405 nm波长处,SEAP的吸光值与酶活力之间、酶活力和蛋白质绝对值之间相互换算的两个公式:y(酶活力)=(x(吸光...     

GUS和HPT基因的基因枪法转化水稻

以水稻（丹粳－５号）愈伤组织为受体材料，采用基因枪法将含有ＧＵＳ和ＨＰＴ基因的ＣＭ２质粒导入水稻细胞．经过５０ｍｇ／Ｌ的潮霉素筛选，获得抗性愈伤组织，并在同样筛选压力下诱导分化成苗，获得抗性苗．共获得１７个抗性克隆．ＧＵＳ组织化学检测表明，有１２个克隆为ＧＵＳ阳性，ＧＵＳ和ＨＰＴ基因共表达率为７０％左右．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子检测证明ＨＰＴ基因已整合到水稻基因组中．     

水仙胚性愈伤的获得及农杆菌介导GUS基因的遗传转化

用正交实验设计对前期影响水仙胚性愈伤诱导和分化关联性大的因素进行综合分析,结果显示,培养基类型、激素及处理方式、不同添加物等对水仙外植体胚性愈伤诱导及分化的影响是基于培养基的多因素协同效应。水仙适宜胚性愈伤诱导培养基是:改良MB+NAA(0.2 mg/L)+6BA(2 mg/L)+ABA (2 mg/L)+AgNO3(5 mg/L);适宜的分化培养基是：改良N6+2,4D(0.5 mg/L)+6BA(2.5 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)+ABA(2 mg/L)。实验中观察到水仙体细胞胚的发生,在胚性愈伤诱导和分化体系优化基础上实现农杆菌介导GUS基因转化,稳定表达抗性愈伤GUS染色显示最佳胚性愈伤诱导培养基能促进水仙外植体感受态的形成,有利于外源基因的接受,PCR检测表明实验中获得3株转GUS基因阳性植株。     

抗冻蛋白-GUS基因诱导性融合表达载体转化烟草植株中GUS活性测定

把修饰合成的带有甘薯信号肽序列的抗冻蛋白成串基因与β-葡萄糖醛酸苷酶(GU S)报道基因融合克隆在大豆热休克启动区下游构建了温度诱导型双元载体pBF 04,三亲株配对法转化根癌农杆菌,叶盘法导入烟草,获得了转基因烟草植株.将10株转基因烟草放置在40℃诱导不同时间,利用荧光光度分析法测定水解液中GU S活性,结果诱导18、24、48小时的4株中GU S活性明显高于对照组和诱导6、12小时组,说明我们修饰合成的抗冻蛋白与GU S基因融合构建的载体在热休克启动区控制下可以诱导表达.经组织化学法测定这些阳性植株的叶片和茎段切片细胞间隙显示GU S活性,提示甘薯信号肽可能起作用.     

水稻Os05g0442400基因启动子分析以及由Os05g0442400基因启动子引导GUS报告基因在转基因水稻中的表达

采用Plant CARE和PLACE软件分析预测水稻Os05g0442400基因启动子序列中可能存在的顺式作用元件.结果显示,在起始密码子ATG上游1500bp区域内,除了启动子基本的核心作用元件外,还存在一些与植物抵御非生物胁迫过程有关的作用元件、脱落酸应答元件、光诱导启动子作用元件、病原菌诱发因子作用元件,以及根特异性结合位点.采用根癌农杆菌介导法成功将Os05g0442400 promoter::gus构建导入"中花11"水稻.由不同组织部位GUS染液检测表明:在水稻苗期,内源Os05g0442400基因可能主要在根部表达;随着水稻生殖期的延续,水稻内源Os05g0442400基因在颖壳中的表达区域由上向下面积增大,并在抽穗后达到最大表达区域.这些结果可能与Os05g0442400基因启动子上分别存在根特异性结合位点和光诱导启动子作用元件具有一定的联系.     

筛选p53靶向药物的细胞模型的构建

为了筛选可以恢复肿瘤细胞中p53功能的小分子,作者用表达野生型p53的人类直肠癌细胞HCT116建立了一株能够应答激活p53信号通路的荧光素酶报告基因的稳定细胞系,同时用表达野生型p53的人类骨肉瘤细胞U2-OS建立了一株能够应答激活p53信号通路的mCherry红色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系.为了检测筛选p53靶向药物的有效性,利用三种已知的以p53为靶点的小分子药物(cisplatin,doxorubicin以及Nutlin-3)处理这两种稳定细胞系,结果显示p53信号通路在这两个稳定细胞系中均能够被激活.为了探索小分子RNA作为恢复p53功能的靶标药物,并进一步验证这两种细胞模型用于药物筛选的可行性,分别检测了MDM2和MDMX的5个不同shRNA.通过比较HCT116稳定细胞的荧光素酶活性和U2-OS稳定细胞中荧光蛋白的荧光强度,我们筛选出了有效沉默MDM2或MDMX的shRNA.数据表明,这两种细胞模型不仅可用作筛选激活p53的小分子化合物的平台,而且可用于筛选激活p53信号通路的小分子RNA.     

基于GA修正因子自调整模糊控制系统研究

基于模糊数的概念建立了带修正因子的模糊模型，在此基础上采用遗传算法（GA）对量化因子和比例因子进行寻优，通过仿真实验验证了该方法的有效性，从而进一步提高了系统的控制性能。     

苜蓿愈伤组织诱导及GUS基因瞬时表达

用电击转化法将质粒pBI121(含GUS基因,β-葡萄糖苷酸酶基因）导入苜蓿愈伤组织的小细胞团内,利用组织化学定位实验检测到GUS基因在受体组织中的瞬时表达。     

用微弹轰击法将GUS基因导入香蕉茎尖组织细胞

用在弹轰击法将外源ＤＮＡ导入香蕉（Ｍｕｓａ，ｓｐｐ）茎尖细胞，以ＧＵＳ基因作为报告基因，用Ｘ－Ｇｌｕｃ浴液对ＧＵＳ基因表达产物进行组织化学鉴定。样品材料细胞中发现有明显的蓝色斑点，而对照则没有。实验说明用微弹轰击法可以将外源基因导入香蕉茎尖组织并在其中成功表达，这为香蕉的外源基因导入工作提供了新的有效途径．     

GUS基因对红豆草部分酶解小细胞团的转化

采用电击法，将大肠杆菌的ＧＵＳ基因（β－葡糖苷酸酶基因为报告基因）导入红豆草部分酶解小细胞团，利用ＧＵＳ基因产物与底物Ｘ－Ｇｌｕｃ反应的组织化学定位试验，检测到ＧＵＳ基因在受体组织中的表达。同时，对部分酶解的程度、不同电压条件下的转化效率以及两种质粒的不同启动子对ＧＵＳ基因表达的强度等进行了讨论。     

用电穿孔法将外源基因高效导入水稻胚盾片细胞

利用电穿孔法将外源基因导入未经前处理的水稻成熟胚盾惩细胞，质粒为ｐＡＣＴ１－Ｆ，其上带有受水稻肌动蛋白基因ａｃｔｉｎ１启动控制的ＧＵＳ（ｕｉｄＡ）报告基因，电穿孔实验的条件为１００μｇＤＮＡ／ｍｌ缓冲液，３１０Ｖ／ｃｍ场强及９００μＦ电容，通过ＧＵＳ基因瞬时表达实验室证明只需一次脉冲处理便可在一个胚上获得几十个数百个转化细胞，并且发现盾片细胞较胚上其它部位的细胞更易于转化。     

转牛酪蛋白基因(αs1一CaseinB)cDNA花生后代的种子蛋白质及叶片Gus酶活性检测

对花生转牛酪蛋白基因cDNA子二代,14株种子胚和子叶全蛋白的SDS-PAGE电泳分析表明,与对照比较7株子二代中均有一条新的蛋白质带,并在子叶和胚中大量表达.对3株子二代及对照花生幼苗叶片的Gus酶活性检测表明1株(2011)Gus酶活性较强.     

pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒的构建及在p44信号通路中的应用鉴定

p53基因是一种重要的抑癌基因,其产物能够与靶DNA特异性结合并激活转录参与诱导细胞凋亡,调控细胞周期,控制细胞的增殖与分化.p44蛋白主要定位于前列腺癌细胞的细胞质,促进癌细胞的增殖.通过shRNA沉默p44的表达后,LNCaP细胞的生长受抑制, p53靶基因TIGAR和GLIPR1的表达增加.为探寻p53是否介导p44对TIGAR和GLIPR1的作用,本研究构建了pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒,并将其分别转染经NT-shRNA慢病毒和p44-shRNA慢病毒感染的LNCaP细胞,比较两者荧光素酶活性.结果显示,重组质粒pGL3-4×PRE-E4-luc构建成功,为进一步研究p53在肿瘤发生发展过程中的作用通路提供了新的手段.但LNCaP细胞中p44并非通过p53作用于TIGAR和GLIPR1基因,具体机制仍有待进一步研究.     

Progress in artificial control system for gene expression

Along with the increasingly wide application of transgenic techniques, new stricter criteria have been raised for controlling the expression of exogenous genes. For these demands, a series of artificial control systems for gene expression have been developed and testified in recent years, which can control exogenous genes expression in exact time and certain level by administration of a specific drug or hormone. The successful construction of these systems offers a practicable method to control precise expression of exogenous gene in organisms, and raises the feasibility of wide application of gene therapy.     

黑颈鹤血清的几项生化指标和染色体组型的研究

采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳、特异性组织化学染色技术和外周血体外培养技术,研究了黑颈鹤血清中乳酸脱氢酸、酯酶、铁传递蛋白和染色体组型,并对它们与生理功能、环境相适应的关系作了讨论,同时还从遗传学角度,对黑颈鹤的进化地位作了探讨。     

生菜基因转化组织培养受体系统的建立

以散叶生菜大速生（Lactuca sativa var. capatata L.）为试材,以MS为基本培养基,采用不同的激素配比,经愈伤组织诱导、芽分化、生根、移植入土四个步骤的离体培养,获得正常的再生植株,建立了散叶生菜大速生的基因转化受体系统,为下一步的基因转化工作提供了有利条件。高效诱导愈伤组织培养基为MS 0.5 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA,高效诱芽培养基为MS 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA。同时确定了子叶外植体对抗生素的敏感性。试验表明,筛选培养基中适宜的卡那霉素选择压在100 mg/L以下,抑菌剂羧苄青霉素或头孢噻肟钠的适宜质量浓度均为300 mg/L。