基因枪介导质粒共转化整合模式的FISH研究

利用多色荧光原位杂交（Multi-color FISH),在基因枪介导共转化的转基因水稻中检出了目的基因barnase-psl片段和报告基因pHcintG。在供试两单株的染色体上,这两个外源基因各有2－3个整合位点。多数情况下,barnase-psl片段与pHcintG整合在染色体的同一位置。同时,选株Q13的伸展DNA纤维荧光原位杂交（Fiber FISH)显示,两基因表现为衔接重复,重复间具有短的间隔。结合Southern杂交结果,对基因枪介导共转化可能的整合模式进行了分析。     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶.采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321,通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达.抗盐抗旱检测结果表明,水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸,各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5～15倍;同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快,苗与根的生物学产量都要高于对照,最后种子产量也显著高于对照,如在0.1 mol/LNaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%～41%,说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用,通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶. 采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321, 通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达. 抗盐抗旱检测结果表明, 水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸, 各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5~15倍; 同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快, 苗与根的生物学产量都要高于对照, 最后种子产量也显著高于对照, 如在0.1 mol/L NaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%~41%, 说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用, 通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

转OsNHX1基因耐盐84K杨的培育

采用农杆菌介导的方法将水稻Na+/H+反向转运器基因OsNHX1导入84K杨, 获得3株抗性转化植株, PCR, Southern 和Northern检测结果表明, OsNHX1基因已经整合到84K杨基因组中, 并可以稳定表达. 耐盐实验表明, 3个株系的转基因植株能在200 mmol/L NaCl条件下正常生长. 对盐胁迫处理的转基因植株进行Na+含量和渗透势测定, 发现转基因植株叶片中的Na+明显高于对照植株, 其渗透势明显低于对照植株. 分子检测和耐盐性实验表明OsNHX1基因的转化获得成功, 并获得84K杨耐盐转基因 植株.     

转生长激素基因促进鲤鱼胸腺的发育

采用显微注射方法, 获得转“全鱼”生长激素(GH)基因鲤鱼(转基因鱼), 并对其胸腺发育进行观察. 1龄F1转基因鱼胸腺显著增大、重量增加. 单侧胸腺最大重量达295 mg, 最小为190 mg, 平均为218.6 mg; 而对照鱼胸腺最大重量仅为81 mg, 最小只有20 mg, 平均为42.5 mg. 转基因鱼与对照鱼胸腺绝对重量之比为5.14︰1, 胸腺重量指数之比为2.97︰1. 显微观察表明, 转基因鱼胸腺高度发达, 外区明显增厚, 胸腺细胞高度密集; 而对照鱼胸腺出现退化, 外区较薄, 淋巴细胞分布较为稀疏, 可见明显的脂肪细胞团. 电子显微镜进一步观察显示, 转基因鱼增生的细胞主要为小淋巴细胞, 未发现结构上的异型性变化. 上述观察证明, 转“全鱼”GH基因明显促进鲤鱼胸腺继续发育、胸腺细胞增生和有效延缓、防止胸腺退化. 实验结果为进一步研究转GH基因鱼的免疫生物学效应奠定了基础.     

转大豆GmDREB基因增强小麦的耐旱及耐盐性

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因表达, 有效提高植物的抗逆性. 利用酵母单杂交技术从大豆(Glycine max)品种吉农27的cDNA表达文库中克隆了一个新的GmDREB基因. 该基因编码174个氨基酸, 具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域, 其中第14与第19位保守氨基酸分别是缬氨酸(V)与谷氨酸(E), 在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区. 利用玉米组成型启动子Ubiquitin和拟南芥诱导型启动子rd29A构建了植物表达载体, 通过基因枪转化小麦品种鲁麦22号, 获得103株T₀代再生植株, 通过PCR检测, 分别获得含Ubi::GmDREB和rd29A::GmDREB的转基因植株13株和11株. T₁代经过PCR, Southern blot, RT-PCR检测, 证明GmDREB基因已经整合到小麦基因组中, 并在转录水平上表达. 携带Ubi::GmDREB或rd29A::GmDREB转基因株系的T₁代植株苗期耐旱或耐盐性鉴定表明, 转基因小麦植株的耐旱或耐盐能力明显提高, 说明GmDREB基因在2种不同启动子驱动下均能有效提高转基因小麦的耐盐、耐旱性.     

转芪合酶基因植物中三羟基反式芪的功能

应用RT－PCR方法,从葡萄组织中克隆了两个芪合酶基因的编码区（1．19kb)。在大肠杆菌中能特异表达42ku的蛋白质,其分子量与芪合酶大小一致,并用其制备了兔抗血清。利用pBin438构建了植物组成型表达载体,经农杆菌介导获得转基因烟草植株。PCR,Southern blot,Western blot和RT－PCR分析证明该基因已整合到烟草的染色体中,并正常转录和特异表达。薄层层析和HPLC的结果进一步判断表达的芪合酶在烟草中可催化其底物合成3,4′,5－三羟基反式芪（trans-resveratrol),从转基因烟草中纯化的3,4′,5－三羟基反式芪能使人乳腺癌细胞停留在Go,G1期的细胞数增加。     

胚胎干细胞多潜能性维持的分子机制

分离于着床前胚胎内细胞团的胚胎干细胞是多潜能性细胞, 在胚泡注射后能产生3个胚层的所有细胞和组织类型. 在合适的培养条件下, 胚胎干细胞保持其多潜能性, 即维持其多向发育潜能及在不分化状态下的对称性细胞分裂能力. 胚胎干细胞的多潜能性是其得以广泛应用的基础. 胚胎干细胞可作为基因敲除或转基因动物的供体细胞、哺乳动物发育的体外模型和再生医学中进行细胞治疗的细胞库. 要实现这些目的, 必须建立化学成分明确的培养体系并在体外长期培养过程中保持胚胎干细胞的多潜能性, 同时应能够对其进行定向诱导分化. 因此, 理解和阐明胚胎干细胞多潜能性维持的分子机制是首要前提. 本文概述了该方面研究的最新进展, 包括LIF/STAT3, BMPs/Smads, canonical Wnt, TGFβ/activin/nodal, PI3K和FGF等信号通路以及oct4, nanog等多潜能性维持相关基因, 并对小鼠和人ES细胞多潜能性维持系统的调控机制及其差异进行了探讨. 进一步阐明这些信号通路和基因之间的相互作用以及胚胎干细胞多潜能性维持系统的调控机制将是未来胚胎干细胞研究领域的主要目标.     

锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶

该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.     

农杆菌介导法获得转pac1基因小麦并表现对大麦黄矮病毒的抗性

自裂殖酵母中克隆得到pac1基因, 与GenBank中相关的核苷酸序列有99.3%的相似性. 编码蛋白质序列分析表明, 其具有RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域. 体外活性测定表明, 以pET-5a系统在大肠杆菌中表达的pac1产物能够降解dsRNA. 将pac1导入双元载体pBI121, 以培养7~10 d的小麦幼胚为受体材料, 利用农杆菌株LBA4404对小麦品种陇鉴127进行转化, 获得了41株G418抗性植株, 经点杂交(dot blot)、RT-PCR和nptⅡELISA检测证实, 其中25株整合有外源基因并能正常表达. 对这25株转基因小麦进行大麦黄矮病毒的抗性鉴定表明, 有12株表现低度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时发病且严重; 有12株表现中度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时局部有不严重症状; 有1株表现高度抗性, 两种情况下均无症状. 抗性实验结果表明了pac1介导的抗性具有剂量效应的特点.     

一新的水稻多蘖矮秆突变体tddl (t) 的分离及基因的精细定位

水稻株型是影响稻米产量的重要农艺性状, 而株高和分蘖是水稻株型的两大构成因素, 因此对水稻多蘖矮秆突变体的研究不仅能为植物生长发育分子机制的阐明奠定基础, 而且具有潜在的农业生产价值. 我们从EMS化学诱变的籼稻IR64的后代筛选得到一稳定遗传的多蘖矮秆且叶色加深突变体, 暂命名为tddl(t), 它与已发现的多蘖矮秆突变体非等位. 该突变体属于dn型矮秆, 其矮秆性状与赤霉素、油菜素内酯和萘乙酸无关, 因此推断其控制基因可能参与其他激素途径. 组织细胞学分析表明, 维管束薄壁细胞的减小导致了茎秆变细. 遗传分析显示, 该性状受单隐性核基因控制, 精细定位将TDDL(T)基因锁定在水稻第4号染色体长臂85.51 kb的物理距离内, 在该区域共预测到20个候选基因. 对该基因的进一步克隆将有助于水稻多蘖矮秆分子机制的阐明和应用于分子标记辅助育种.