Pygo2转基因小鼠模型的建立及表型的初步分析

主要通过建立Pygo2转基因小鼠的模型对其表型进行初步分析.首先构建K14-2×flag-Pygo的转基因构件,经酶切、纯化后构建Pygo2转基因小鼠.出生后的仔鼠用PCR和Western方法检测基因型,并通过进一步的免疫组化验证Pygo2基因的表达.PCR检测获得7只转基因阳性鼠,6只Western检测为阳性.对转基因小鼠子代的胚胎和成体进行免疫组化证明,Pygo2基因在皮肤和乳腺组织中有过量表达.转基因小鼠的皮肤、乳腺以及鼠尾椎骨等组织出现了异常的表型.乳腺中有肿瘤组织的形成,且Pygo2在肿瘤中有大量表达.该模型的成功建立为进一步研究Pygo2的功能奠定了基础.     

Plcd1转基因小鼠的制备

通过制备Plcd1转基因小鼠研究Plcd1基因功能.首先逆转录PCR获得约2.2kb的Plcd1基因全长,T载体克隆后测序验证;以pMD19-T-Plcd1为模板,通过设计引物及PCR扩增引入酶切位点,与pEF6/V5-His同时进行酶切、连接,构建pEF6/V5-His-Plcd1表达载体;经真核表达验证后,酶切获得目标片段,显微注射681枚受精卵,在82只仔鼠中获得转基因阳性首建鼠15只,其中13只稳定遗传并建系.PLCD1-HIS融合蛋白在睾丸组织中表达,在皮肤组织中无表达.Plcd1转基因小鼠为Plcd1功能研究奠定了基础.     

中药对阿尔兹海默症APP/PS1转基因小鼠的治疗作用研究进展

阿尔兹海默症(alzheimer’s disease,AD),是一种中枢神经系统退行性疾病,以老年斑块沉积和神经纤维缠结为主要特征,患者表现为认知能力减退、生活不能自理,该病的预防与治疗已经成为国内外研究的热点。在防治AD的实验研究领域,APP/PS1转基因小鼠模型有着广泛的应用,因为其能较好地反映阿尔兹海默症患者的病理特征、临床表现,是一种较理想的AD动物模型。本文综述近五年来中药对APP/PS1转基因AD小鼠治疗作用的研究进展,以期为后续防治AD的研究提供参考。     

Spexin转基因小鼠的构建及表型初步分析

Spexin是一种具有多种生物学功能的神经肽,在代谢疾病及神经系统疾病中发挥重要作用.为了深入研究spexin的生理功能和相关机制,构建了spexin转基因小鼠,通过检测血液中spexin含量以及糖耐受实验,对模型小鼠进行了初步的表型分析.利用piggyBac(PB)转座子技术培育spexin转基因小鼠,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分别在基因层面和蛋白层面验证了模型动物是否构建成功.之后用饲喂高脂饲料的雄性小鼠进行糖耐受实验,对转基因模型小鼠进行表型分析.PCR结果显示,以靶向spexin的两对引物扩增,转基因型小鼠基因组DNA中能分别扩增出300 bp和301 bp的片段,而野生型小鼠则不能.ELISA结果中,转基因型小鼠血清中spexin含量较野生型小鼠显著升高;同一表型中,雌雄小鼠间血清中spexin水平无明显差异.饲喂高脂饲料85 d内,转基因型小鼠和野生型小鼠体重变化未观察到显著差异;糖耐受结果显示,转基因型小鼠每个时间点血糖浓度均低于野生型小鼠,且在15 min时具有显著性差异.结果显示成功构建了过表达spexin基因的小鼠模型.spexin表达水平的升高在一定程度上提高了C57BL/6小鼠的糖耐受能力.该模型为进一步研究spexin基因在动物体内的功能以及在代谢疾病发病机制中的作用奠定了基础.     

高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立

为解决因目的基因G-C(鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对)含量过高导致的目的基因扩增困难,以及操作过程中多环节引起的DNA污染导致的假阳性问题.本研究以突变型Foxo1(Forkhead转录因子1)转基因小鼠作为对象,就高G-C含量转基因的PCR方法和多个环节避免DNA污染进行了探索,结果显示,实验中消除了PCR的假阴性和假阳性现象,得到了准确的突变型Foxo1转基因小鼠的基因型鉴定结果.     

脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1转基因小鼠制备

目的制备脑组织特异性表达胰岛素样生长因子-1(Insulin-Like Growth Factors 1,IGF-1)转基因小鼠。方法采用精子为载体法进行基因转导,出生后小鼠PCR检测,建立转基因小鼠系,用Western blot和免疫荧光法分别检测转基因小鼠海马齿状回亚粒状区(subgranular zone,SGZ)IGF-1表达量和报告基因EGFP阳性细胞数。结果获得3只阳性小鼠,2只外源基因能稳定遗传,并建立了转基因小鼠系,转基因鼠SGZ区域IGF-1表达量显著高于正常鼠,EGFP也在此区域表达。结论成功制备IGF-1转基因小鼠。     

APP/PS1双转基因小鼠鉴定及生物学功能研究

通过对APP/PS1双转基因小鼠尾部组织进行DNA提取,后续采用PCR扩增、琼脂凝胶电泳实验方法进行条带分析鉴定,比较蛋白酶K法和碱裂法对DNA提取差异,通过行为学实验、免疫荧光实验和Western blot检测小鼠病理产物的表达以验证APP/PS1双转基因小鼠生物学功能改变.结果显示,与蛋白酶K法相比,碱裂法提取的DNA浓度明显较高(P<0.001),纯度无显著性差异(P>0.05).水迷宫行为检测结果显示,定位航行实验中,与野生型比较,两组APP/PS1小鼠平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05,P<0.01,P<0.001),空间探索实验中,与野生型比较,两组APP/PS1小鼠穿越平台次数明显减少(P<0.05,P<0.01),目标象限停留时间明显缩短(P<0.01).Y迷宫实验结果显示,与野生型比较,两组APP/PS1转基因小鼠自发交替准确率明显降低(P<0.01).免疫荧光实验结果显示,与野生型小鼠比较,两组APP/PS1转基因小鼠脑部明显产生Aβ沉积(P<0.01,P<0.001).Western blot结果显示,与野生型比较,两组APP/PS1转基因小鼠海马组织Aβ表达量明显增多(P<0.05).以上结果表明,APP/PS1双转基因小鼠在8月龄出现明显Aβ沉积及行为学改变,在DNA提取方面,蛋白酶K法和碱裂法对APP/PS1双转基因小鼠的DNA提取均准确无差异,碱裂法具有简单高效的优点,在常用的定性鉴定方面具有优势.     

血管内皮生长因子C嵌合体（CA65）转基因小鼠的建立和分析

将血管内皮生长因子C嵌合体CA65插入角蛋白14（keratin 14,K14）启动子下游,构建了嵌合体CA65转基因表达载体,通过显微注射法建立转基因小鼠.利用特异引物聚合酶链式反应法鉴定转基因小鼠的基因型后,通过逆转录聚合酶链式反应检测嵌合体CA65的表达水平,证实成功建立了皮肤特异表达嵌合体CA65转基因小鼠.对...     

Balb/C小鼠金属硫蛋白一1 cDNA的克隆及序列分析

以RNA一步提取法，采用RT-PCR技术成功地将Balb/C小鼠金属硫蛋白-1cDNA基因片段克隆于质粒pUC-19上，并对克隆片段cDNA进行核苷酸序列测定.     

Balb/C小鼠金属硫蛋白-1 cDNA的克隆及序列分析

以 RNA一步提取法 ,采用 RT-PCR技术成功地将 Balb/ C小鼠金属硫蛋白 -1 c DNA基因片段克隆于质粒 p UC-1 9上 ,并对克隆片段 c DNA进行核苷酸序列测定     

拟南芥温敏雄性不育突变体atms1的获得及表型分析

从甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate,EMS）化学诱变建立的野生型拟南芥（Col-0）突变体文库中筛选到1株突变体.在低温16 ℃时,该突变体的雄性育性与野生型没有显著差异,花粉染色呈现100%可育.随着培养环境温度的升高,突变体花粉育性逐渐下降,因此,该突变体为一温敏雄性不育突变体,并被命名为atms1（ambient temperature-sensory male sterility 1,即环境温度敏感雄性不育1）.花药切片结果显示,在23 ℃以下,该突变体花药各个发育时期的形态与野生型花药没有显著的差异;而27 ℃处理1周后的突变体花药呈现多种表型：同一朵花中各个花药的发育时期出现显著分化,花粉母细胞胼胝体单薄,绒毡层发育滞后于同时期的野生型花药.遗传分析确定,atms1的不育表型是由单个隐性核基因控制的.     

BABL/c突变卷毛小鼠免疫学特性指标的分析

目的 探讨BALB/c突变卷毛小鼠与BALB/c小鼠之间的免疫学指标是否存在差异。方法 选择6周龄的BALB/c突变卷毛小鼠和BALB/c小鼠各20只(雌雄各半),分别使用全自动血细胞分析仪检测6项血液免疫细胞指标;使用全自动生化仪检测4项抗体和补体指标;ELISA法检测血清细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4水平;并对两组结果进行对比分析。结果 两组小鼠NE、NE#和MO的雌性及组间结果相比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),两组小鼠LY的雌性结果相比较具有显著性差异(P<0.05);两组小鼠IgM的性别及组间结果相比具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),两组小鼠的IgG和C3的雄性及组间结果相比较具有显著性差异(P<0.01),两组小鼠IL-4的雌性及组间结果相比较具有显著性差异(P<0.05)。结论 BALB/c突变卷毛小鼠和BALB/c小鼠的血液免疫学指标存在差异,提示突变基因可能对小鼠的免疫系统产生了一定的影响。     

小鼠过敏性疾病模型的建立

为探索建立小鼠过敏性疾病模型的最佳条件,利用OVA与Alum混合的致敏原致敏BALB/C小鼠,建立过敏性疾病动物模型,采用正交试验的方法研究OVA剂量,Alum剂量与刺激频率3因素的3个不同水平对受试小鼠血清总IgE的影响,评价建立小鼠过敏性疾病模型的最佳条件.经直观计算与统计学分析,针对OVA与Alum混合致敏原致敏BALB/C小鼠模型,最佳试验条件为每次每只小鼠注射50μg OVA与含4mg Al(OH)3的Imject Alum明矾佐剂的混合液0.2mL,每隔4d注射1次,共注射4次.该试验为研究食品抗过敏功能提供了建立过敏性疾病动物模型的简便易行的方法,并提示在建立模型时应注意多试验因素的合理搭配.     

野生型及突变型HIV-1 LTR驱动的荧光素酶稳定表达细胞株的建立

HIV潜伏感染是造成抗病毒疗法无法根除病人体内病毒的主要原因.建立有效的药物筛选模型,是成功筛选高效、低毒性HIV潜伏激活剂的关键.本研究中,我们构建了野生型及κB和TAR顺式元件突变型HIV-1LTR驱动的荧光素酶表达载体,并通过质粒转染人胚肾293细胞,通过G418筛选,获得了稳定表达的细胞克隆.从每个克隆中抽提基因组DNA,进行PCR扩增和序列分析,结果显示:报告载体稳定整合在细胞基因组中.进一步通过TNF-α去处理这些细胞模型,结果显示:10ng/mL TNF-α可以有效地激活野生型LTR和ΔTARLTR细胞,对ΔκB LTR细胞中荧光素酶表达水平没有影响.激活效果还在同一细胞的不同细胞克隆中得到了重复验证.     

肠道真菌过增殖小鼠模型的建立

通过给予头孢曲松造成SPF级BALB/c小鼠(Mus musculus)发生肠道菌群紊乱,进而通过连续灌胃密度为2×107CFU/mL的白假丝酵母(Candida albicans)菌液以建立小鼠肠道真菌过增殖模型;通过镜检、活菌计数、结肠组织病理切片、电镜观察等方法评价白假丝酵母在小鼠体内黏附定植的情况。实验结果显示,大剂量头孢曲松处理后,活菌计数结果显示小鼠肠道菌群出现重度失衡;灌胃真菌后,镜检可见酵母相和菌丝相的白假丝酵母,PAS染色可见小鼠结肠粘膜表面黏附有大量染成红色的圆形真菌孢子;扫描电镜观察发现小鼠结肠表面黏附大量卵圆型白假丝酵母的酵母相细胞。研究认为大剂量抗生素处理结合真菌灌胃,可成功建立小鼠肠道真菌过增殖模型。
     

ICR小鼠破伤风疾病模型的建立

目的建立破伤风疾病模型,以期完善破伤风梭状芽孢杆菌的研究。方法采用ICR小鼠作为实验动物,通过腹腔注射破伤风痉挛毒素（TeNT）,观察小鼠行为变化,观察和比较各组小鼠的肺部、肝部、脑部组织外观及组织病理变化。结果破伤风痉挛毒素进入机体内,可以阻断平滑肌收缩和离子通道,造成机体痉挛、四肢强直、角弓反张,最终导致机体死亡。切片观察到脑部小胶质细胞弥漫增生,引发肺部感染,肝组织内胆管增生。当毒素剂量低于10 -4 试验量时,破伤风痉挛毒素不会导致小鼠死亡。结论成功建立ICR小鼠破伤风疾病模型。     

化疗性静脉炎小鼠模型的建立

目的通过静脉注射氟尿嘧啶建立稳定有效的化疗性静脉炎小鼠模型。方法 42只昆明小鼠按照给药浓度随机分为7.5 mg/mL、10.0 mg/mL、12.5 mg/mL,15.0 mg/mL、17.5 mg/mL和22.5 mg/mL共6个实验组和1个对照组。实验组小鼠分别从左侧鼠尾静脉注射0.4 mL不同浓度的氟尿嘧啶溶液,对照组注射0.4mL的生理盐水。给药后第3 d对化疗性静脉炎表现进行分级评价后处死。制作石蜡切片并进行镜下分级。结果随注射氟尿嘧啶剂量的增加,小鼠静脉炎发生率也逐渐增高,350 mg/kg(17.5 mg/mL组)以上剂量组动物出现中毒死亡。300 mg/kg(15.0 mg/mL)剂量组化疗性静脉炎发生率达100%,无动物死亡,出现典型的静脉炎症状,对照组未出现类似变化。结论通过小鼠尾静脉注射300 mg/kg～350 mg/kg剂量范围的氟尿嘧啶可成功建立稳定有效的化疗性静脉炎小鼠模型。     

C57BL/6小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎模型的建立

目的 为更好地研究多发性硬化症(MS)的发病机理、开发具有良好效果的MS治疗药物,建立起能高度模拟人类多发性硬化症发生发展的小鼠模型则显得尤为必要且具有极高的应用价值。本文使用已广泛应用的标准化C57BL/6小鼠作为实验对象,成功地构建了实验性变态反应性脑脊髓炎模型(EAE)。此模型为研究人类多发性硬化症的发病机理及开发相关临床治疗药物提供了良好的小鼠模型。方法 C57BL/6雄性小鼠20只,分为2组。EAE组10只,皮下注射混匀的弗氏不完全佐剂与MOG53-58及结核分枝杆菌的悬浊液,同时分别在day0和day2腹腔注射百日咳毒素0.2μg/只;正常对照组10只,仅注射生理盐水。采用HE染色方法观察小鼠组织学变化;免疫组织化学方法进一步研究小鼠病理变化。结果 从抗原免疫后第10天开始EAE组小鼠陆续发生EAE临床症状且发病率达到100%,而正常对照组小鼠未发生任何EAE临床症状。组织病理学结果分析显示,EAE组小鼠脊髓及脑组织中出现大量炎性细胞浸润且脱髓鞘严重。结论 本实验成功构建的EAE小鼠模型病程稳定且发病率高,可用于MS机制研究及MS防治药物的筛选。