植物基因克隆的方法和策略

芬子生物学的迅速发展对克隆植物基因起了积极的推作用，本篇旨在介绍植物基因克的策略及研究进展。     

神经生长因子在眼科学中的应用展望

神经生长因子是近10年神经生物学研究的主要内容和热点之一。本文概述了从神经生物学的各个方面如神经胚胎发育学、神经生理、神经化学、神经免疫、神经病理和神经药理对神经生长因子的研究进展,并阐述了视觉神经生物学如视神经的再生等与神经生长因子的关系,讨论了其在临床医学中的应用状况和眼科学中的应用前景。     

人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达

将hNGFB基因插入甲醇营养性酵母P .pastoris分泌表达载体pHIL S1和E .coli表达载体pET 15b中 ,相应转化P .pastorisGS115 (Mut+,His- )和E .coliBL2 1(DE3 ) .在不含组氨酸平板上生长的酵母转化子通过PCR进一步筛选阳性克隆 ,P .pastoris重组菌株的蛋白电泳表明发酵液中有特异表达带 ,扫描分析占细胞外泌总蛋白的 14 .4% ,Westernblotting证实该分泌蛋白具有hNGF的免疫活性 .E .coli重组菌株在IPTG的诱导下表达融合蛋白 .电泳扫描分析表达的融合蛋白占细胞总蛋白量的 10 .3 % ,Westernblotting检测表明具有免疫活性 .     

蒙塔尔奇尼:神经生长因子的发现者

正神经生长因子的发现为神经生物学乃至整个生物学开辟了一个全新的研究领域。极大地拓展了对细胞间相互作用过程的理解与认识。生长因子是一类由机体自身产生并具有促进细胞生长、增殖和分化等多种生物学功能的活性物质。生长因子通过与靶细胞膜上特异受体的结合,进而激活细胞内的下游事件来发挥生物学活性。在包括神经系统、造血系统、呼吸系统和消化系统等在内的几乎所有系统的发育和正常功能保持过程中都发挥关键性作用。     

几个免疫相关的丝氨酸蛋白水解酶的神经生长因子活性

用江浙蝮蛇毒中分离纯化复到的具有高神经生长因子活力的蛋白－神经生长因子样蛋白水解酶免疫家名义,得到抗血清。     

百岁丽塔与神经生长因子

因发现神经生长因子（NerveGrowthFactor）享誉科学界的丽塔·L·蒙塔尔奇尼（Rita L．Montalcini），在其百岁生日到来之际，《自然》杂志报道了这位与众不同的从家庭实验室走进意大利参议院、并于1986年获得诺贝尔医学奖的意大利女科学家的科研生涯和发现神经生长因子的故事。     

几个免疫相关的丝氨酸蛋白水解酶的神经生长因子活性

用江浙蝮蛇毒中分离纯化得到的具有高神经生长因子活力的蛋白———神经生长因子样蛋白水解酶免疫家兔 ,得到抗血清 .初步分离抗体并以此抗体为配基制备了亲和柱 .江浙蝮蛇粗毒经过该亲和柱分离并进一步经FPLCMonoQ柱层析得到几个不同组分 ,其中含量较高的组分Ⅱ和组分Ⅲ分别被纯化 .组分Ⅱ ,组分Ⅲ与神经生长因子样蛋白水解酶的N端序列均与蛇毒中的丝氨酸蛋白水解酶高度同源 ,而且三者均具有不同高低的蛋白水解酶活力 .但是 ,它们的NGF活性却不同 ,其中神经生长因子样蛋白水解酶的NGF活力与NGF相当 ,而组分Ⅱ也略有NGF活力 ,组分Ⅲ则完全不具有NGF活力     

BRCAA1基因克隆、染色体定位与特征性分析

本介绍了一个克隆新的乳腺癌相关抗原基因BRCAAl．它定位于lq^42．1-q^43，它的基因组长度为93．857kb，包含18个外显子与17个内含子．它编码的蛋白由1214个氨基酸组成，相对分子质量为136．8kd，包括10个糖基化位点，含有一个Rb结合蛋白1的抗原表位IKPSLGSKK，潜在的抗原表位可能位于580～620，640-700氨基酸位点之间．它可能是Rb结合蛋白1家族的成员，可能具有调节细胞增殖的功能．     

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

<正>泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.     

一个水稻大叶角度突变体lla的遗传分析及基因克隆

突变体是遗传学研究的基本材料. 利用突变体克隆水稻基因, 并进而研究基因的生物学功能是水稻功能基因组学的重要研究内容. T-DNA标签法是众多克隆植物基因方法的一种. 其优点是一旦确定突变性状由T-DNA插入引起, 就可以通过测定T-DNA的旁侧序列而快速分离到相应的突变基因. T-DNA标签法已广泛应用于拟南芥基因克隆中, 据统计有40%的拟南芥突变基因是用T-DNA标签法克隆的[1]. 近年来, 国内外众多研究人员采用不同的T-DNA标签系统构建了大量的水稻T-DNA插入突变体库[2~6]. 目前, 已有3例用T-DNA标签法成功分离水稻基因的报道[7~9]. ......     

水稻三角颖突变体tri1的遗传分析与基因克隆

籽粒形状与大小是影响水稻产量和品质的重要因素. 本研究在经⁶⁰Co-γ射线辐射粳稻品种台北309的后代中分离获得一个三角颖突变体tri1(triangular hull 1). 与野生型相比, tri1籽粒颖壳呈三角形, 粒厚增加, 蛋白质含量升高, 株高和千粒重降低. 遗传分析表明, 该突变性状能稳定遗传, 受一对隐性核基因控制. 采用图位克隆法将目的基因精细定位于水稻第1染色体长臂上分子标记CHR0122与CH0127之间, 物理距离约47 kb, 并与分子标记CHR0119共分离. 在该区域内共有6个候选基因, 测序分析表明tri1突变体中一个释义基因OsMADS32的第3外显子内缺失了一个碱基A, 导致移码突变和翻译提前终止; RT-PCR分析表明, OsMADS32主要在水稻幼穗中表达, 在根、茎、叶和发育的种子等组织中的表达量极低, 说明OsMADS32基因与花的发育与关. 据此, 推测OsMADS32基因可能为TRI1的候选基因.     

一个与人鼻咽癌相关新基因的克隆

利用高密度ｃＤＮＡ微阵列表达检测技术,筛选出在成人正常鼻咽组织高表达而在成人咎咽低分化鳞状细胞癌组织中低表达的ＥＳＴＮ２７７４１,用ＲＴ－ＰＣＲ技术证实之,进而由该ＥＳＴ克隆出长度为１０９６ｂｐ的新基因,利用生物信息学分析发现,该序列有含有完整的阅读横架,编码２５６个氨基酸,在５＇端起始密友子上游有终止密友子ＴＡＡ,３＇端有加尾信号ＡＡＴＡＡＡ和ｐｏｌｙ Ａ尾,该新序列在非宙余的核酸序列数据 比     

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.1 材料与方法(1)菌种及培养基 泡盛曲霉(Aspeergillus awamori)NMRL3112,葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因供体,采用文献的培养基;酒精酵母(Sacchromyces cerevisiae)AS.2.1364为葡萄糖淀粉酶基因受体,采用YPD培养基;转化酵母采用YPDS培养基,含1%葡萄糖和1%可溶性淀粉.大肠杆菌TG1作为pAC1(由刘宏迪保存)及测序质粒pGEM-3zf( )的宿主菌,采用LB培养基,氨卞青霉素抗性.     

人胃癌细胞株c-Ha-ras基因上游区2.5kb片段的克隆和分析

在人类恶性肿瘤的细胞株或实体瘤组织中,人们过去发现c-Ha-ras基因改变的主要形式多为点突变。但是,该基因上游区和下游区对基因转录的调控、以及转录调控在肿瘤发生中的作用逐渐引起人们的重视。1985年,本实验室从人胃癌细胞株BGC-823中克隆分离出c-Ha-ras基因,并证明该基因的第12位密码子发生了点突变。从二轮转化细胞Rat 3-3基因组文库分离出来的含有c-Ha-ras基因的克隆又120,在c-Ha-ras基因5′上游端含有一     

人视神经瘤和胶质瘤细胞系的睫状神经营养因子表达和克隆

睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor,CNTF)是第一个被发现可促进离体和在体运动神经元存活、对神经系统正常发育和受损神经的再生修复有重要作用的神经因子,主要存在于星形胶质细胞和施旺细胞.人CNTF基因定位于11号染色体长臂的近例端,其基因结构不与神经营养素家族同源也不含信号肽.我们发现大鼠坐骨神经再生过程中CNTF的基因表达下调,提示它的表达量与损伤后胶质细胞的增殖未必匹配.国外已重组了人CNTF,国内尚未见报道.由于我们没有人系统神经的cDNA文库,故用大鼠CNTFcDNA探针来检测人视神经胶质细胞瘤和人脑胶质母细胞瘤细胞系中是否有人CNTF的表达,再用反转录PCR克隆出人CNTF cDNA,目的是获得重组的人CNTF蛋白.     

人及猪脑源性神经营养因子基因克隆

脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)主要是在中枢神经系统内合成的小分子量碱性蛋白质,由119个氨基酸组成.研究发现BDNF对神经系统的多种神经元均有效应,在体与离体观察证明,它可维持与促进外周神经嵴和基板来源的多种感觉神经元的发育、生长与分化,对中枢神经系统的基底前脑胆碱能神经元、GABA能神经元、中脑黑质多巴胺能神经元具有营养作用.研究还发现BDNF与神经生长因子(NGF)同属一个基因家族,二者在生物效应上有许多类似之处,但其作用的神经元特异性又有所不同.     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

人神经元电压门控钙通道γ-3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析,得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在 ４３５ ｂｐ中有 ７５％同源的 ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｗ２９０９５）．在该 ＥＳＴ中设计引物与 ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ反应,在人脑前叶皮质 ｃＤＮＡ文库和人脑 Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得 ｃＤＮＡ序列 １５４５ ｂｐ,其中包含一个 ９４８ ｂｐ的可读框,编码 ３１５个氨基酸．该可读框经确证命名为 ＣＡＣＮＧ３．ＣＡＣＮＧ３基因与大规模测序中定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１的ＢＡＣ克隆ＡＣ００４１２５完全一致,从而将该基因定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１,并由此获得它的基因组结构,编码区由４个外显子组成．经ＲＴ－ＰＣＲ分析,ＣＡＣＮＧ３在成人脑和胎脑有表达．运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ在视网膜色素变性家系、视网膜色素变性伴耳聋和癫痫家系进行突变检测,未检测到突变．     

编码蚯蚓纤溶酶组分A基因的cDNA克隆及表达

蚯蚓纤溶酶组分A是赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内纤溶酶的主要组分之一，具有双重纤溶活性，用逆转录PCR(RT—PCR)的方法从赤子爱胜蚓中克隆了编码蚯蚓纤溶酶组分A的cDNA，由其推测的氨基酸序列与丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶家族的成员具有较高的同源性，而且具有其保守的催化位点，表明该蛋白质可能是胰蛋白酶家族的成员．将上述cDNA导入大肠杆菌的表达载体pQE31和pMAL—c2X，构建表达质粒pQE—efea和pMAL—efea，这2个表达质粒均可以在大肠杆菌苗株M15中诱导表达出与预期大小相近的重组蛋白。其中，pQE—efea表达的His6—EFEa主要以包涵体形式存在，而pMAL—efea表达的重组蛋白MBP—EFEa是可溶性的，并且具有纤溶活性。