角毛壳菌β-1,4-内切木聚糖酶基因的生物信息学分析

利用BlastX将角毛壳菌(Chaetomium cupreum)ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性比对搜索,获得β-1,4-内切木聚糖酶基因全长cDNA序列。cDNA序列全长690bp,编码229个氨基酸,蛋白分子量为57.89kD,理论等电点为5.07。蛋白质的二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主。细胞亚定位分析表明该蛋白主要在胞外发挥水解木聚糖的生物学作用。     

角毛壳菌泛素结合酶基因的克隆和特性分析

利用BlastX将角毛壳菌(Chaetomium cupreum)几丁质诱导的菌丝体cDNA文库中的ESTs序列与NCBI的Nr(Non-redundant)数据库进行相似性搜索,获得泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)基因的ESTs.以此结果设计引物进行RT-PCR,克隆该基因的cDNA序列(CcE2).该序列长600bp,开放阅读框444bp,编码147个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为16.6ku,是亲水性蛋白.BlastP分析表明该基因进化相当保守,与其他真菌的E2具有高度的相似性;三维结构分析显示CcE2仅包含一个功能结构域,在结构域的中央是决定CcE2活性的半胱氨酸残基活性位点.     

粉尘螨Der f4基因的克隆和蛋白分子特征分析

从深圳地区采集粉尘螨纯培养,提取总RNA,根据香港中文大学合成的尘螨基因序列并设计的引物,RT-PCR扩增出Der f4基因,克隆到pUC57载体后测序和进行生物信息学分析.将该目的基因克隆到pET-28a表达载体上得到重组质粒pET-28a-Der f4.用生物软件分析尘螨变应原Der f4序列. RT-PCR获得目的基因Der f4 cDNA全长为1593 bp.推测编码蛋白由526个氨基酸组成,生物信息学分析表明,Der f4具有多种磷酸化位点,含有信号肽,为疏水性蛋白,包含淀粉酶抑制剂功能结构域.获得Der f4基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有淀粉酶抑制剂活性.     

药用植物黄花蒿ATP合成酶电子克隆及生物信息学分析

本文通过电子克隆的方法获得黄花蒿ATP合成酶的基因完整序列并对该蛋白特性进行相应分析.以Accession number KJ434435.1为探针,对黄花蒿的EST数据库进行搜索,获得同源较高的序列,用相关生物软件DNAMAN、MEGA进行拼接组装,并对获得核苷酸和氨基酸进行生物信息学分析.结果发现获得黄花蒿ATP合成酶基因拼接群1963bp,含有一个完整的开放阅读框(ORF)序列(1479bp),编码492个氨基酸,该蛋白质含15个α螺旋,23个β折叠及27个无规则卷曲.黄花蒿ATP合成酶蛋白的分子质量为52830.4,分子式为C_(2342)H_(3778)N_(636)O_(721)S_(14),理论等电点为5.18,该蛋白的GRAVY值为-0.048,具有亲水性的水溶性蛋白.该蛋白质序列有丝氨酸磷酸化位点(Ser)9个、苏氨酸磷酸化位点(Thr)6个、酪氨酸磷酸化位点(Tyr)4个.通过分析获得黄花蒿ATP合成酶完整的c DNA序列,该氨基酸序列不存在信号肽,无跨膜现象、非分泌型蛋白,为黄花蒿ATP合成酶实验室研究提供一定的理论基础.     

粗毛栓菌atp9基因的克隆、表达及序列分析

ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与多种氧化磷酸化和光合磷酸化反应.atp9基因是ATP合酶的重要组成部分,其编码了ATP合酶A亚基上第9亚单位,与呼吸作用和光合作用密切相关.本研究利用atp9基因在进化过程中高度保守的特点,据已知近缘真菌基因序列,设计并合成了一对引物,以粗毛栓菌mRNA反转录得到的cDNA第一链为模板,PCR扩增得到atp9基因完整序列,并连接于原核表达载体pET32a(+)上.测序与序列分析表明:该克隆片段全长222 bp,共编码73个氨基酸,翻译的蛋白质分子量是7.35 kDa.转化大肠杆菌后经IPTG诱导,可高效表达外源融合蛋白,分子量大小与预测结果一致.经过同源比对和进化树分析,该克隆基因编码的氨基酸序列与可可丛枝病菌(Crinipellis perniciosa)和瓣环栓菌(Trametes cingulata strain ATCC 26747)中相对应的氨基酸序列相似度最高.本实验为未来进一步研究粗毛栓菌atp9基因和其蛋白功能,阐明其调控和作用机制奠定了基础.     

人Megalin基因四个结构域的cDNA克隆

以人肾脏组织cDNA为模板,用PCR技术克隆了编码人Megalin基因四个结构域的cDNA,并对其进行了测序.结果表明,编码人Megalin基因四个结构域的cDNA长度分别为863bp、1,008 bp、1,247 bp及1,359 bp.编码第一结构域的cDNA序列与GenBank报道的序列有99.9%的同源性,其中两个位点有差异(第457位和605位分别为C和G,而非G和A);其余三个结构域对应的基因序列与GenBank报道的序列完全相同.     

毛竹硅转运基因PhLsi1的ORF克隆及生物信息学分析

以水稻硅的内转运蛋白基因Lsi1的cDNA序列为信息探针,对毛竹的核酸数据库进行同源性搜索,获得全长为797bp的毛竹硅内转运蛋白基因的cDNA序列(Genbank登陆号:FP095571).与水稻Lsi1的cDNA序列相比,毛竹中该基因cDNA序列第721位处发生终止突变,导致毛竹Lsi1丢失了86个氨基酸残基.采用RTPCR方法对其进行克隆,序列分析表明,PhLsi1基因在编码时确实存在提前终止现象,共编码212个氨基酸,与水稻、玉米和大麦中已克隆的硅内转运蛋白(silicon influx transporter,含有6个跨膜螺旋区和2个NIP保守基序)的序列相似性分别高达99.3%,91.9%,91.9%,但只具有5个跨膜螺旋区和1个NIP保守基序.     

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.     

元江普通野生稻金属硫蛋白基因的获得和序列分析

对SMARTTM技术构建的元江普通野生稻叶片cDNA文库进行随机测序,获得了元江普通野生稻的金属硫蛋白基因cDNA序列.该序列全长525 bp,开放阅读框长186 bp,编码62个氨基酸,10个半胱氨酸集中分布在肽链的N端和C端,该蛋白的分子量为6.42 kD,理论等电点为5.21.氨基酸序列(Blastp)同源性分析表明该基因属于金属硫蛋白家族.     

斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE方法获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein,TBT-bp)肝脏基因的cDNA全长序列.TBT-bp基因cDNA序列全长836 bp,含696 bp的开放阅读框,编码231个氨基酸.虽然编码蛋白序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和底鳉(Fundulus heteroclitus)TBT-bp2序列同源性不高(分别为52%、20%),但是保守的信号肽序列结构与二级结构分析提示它们属于同一蛋白家族.系统树分析表明,此次克隆得到的斜带石斑鱼三丁基锡结合蛋白基因cDNA序列属于2型三丁基锡结合蛋白(tributyltin-binding protein type2,TBT-bp2).斜带石斑鱼TBT-bp基因cDNA全序列的获得为海水养殖鱼类中三丁基锡的去毒代谢相关分子机理研究奠定了基础,对今后进一步进行种苗育苗的研发,并以此为依据提高其人工育苗及仔鱼成活率有重要意义.     

家猪BMP-2、BMP-3基因克隆及其组织表达探究

本研究以长白猪(Landrace)肺cDNA为模板,扩增获得猪骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-3基因的cDNA全长.BMP-2基因cDNA全长为1742bp,编码395个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-2基因的氨基酸序列一致性分别94.18%,95.4%,95.2%,90.3%,90.60%;BMP-3基因cDNA全长为1639bp,编码475个氨基酸的前体蛋白,猪与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-3氨基酸序列的一致性分别是84.7%、87.7%、82.3%、80.4%、79.5%.采用RT-PCR方法,对BMP-2、3基因在家猪主要组织的表达进行探究.结果显示:BMP-2在所有组织中均有表达;而BMP-3在脑、肺、小肠中表达量较高,其他组织中表达量弱.     

灯盏花matK基因序列分析及分子鉴定

药用植物灯盏花在使用中会与飞蓬属或紫菀属植物混淆,对灯盏花mat K基因生物信息学分析及灯盏花植物形态的研究,实现灯盏花与混淆植物的鉴定.采用PCR方法扩增并克隆了灯盏花mat K基因,对该基因进行生物信息学分析,结果显示,灯盏花mat K基因总长为1 317 bp,编码438个氨基酸,无信号肽,无跨膜结构,表现为亲水性,二级结构以α螺旋、β折叠为主,亚细胞定位预测mat K基因位于真核生物的叶绿体中,有8个蛋白结合区和3个多核苷酸结合区,用植物形态、氨基酸序列变异和系统进化树相结合,可以达到鉴别灯盏花与混淆物种作用.     

猪Akt1、Akt2基因克隆与组织表达图谱分析

为了得到长白猪蛋白激酶Akt1和Akt2基因序列并分析其表达模式,本研究使用RT-PCR方法,首先克隆了蛋白激酶Akt1和Akt2的cDNA.序列分析显示:长白猪Akt1基因的cDNA全长1461bp,编码具480个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠同源性达到97%以上.长白猪Akt2基因cDNA全长为1505bp,编码具481个氨基酸残基的前体蛋白,其氨基酸序列与人,牛,大鼠,小鼠的同源性高达97%以上.SMART分析表明,猪Akt1和Akt2蛋白均包含了与PI-3K结合的PH结构域及2个具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域.RT-PCR检测结果显示:Akt1mRNA在垂体、心脏、肝脏、脾脏、肌肉组织中高表达,在大脑、小脑、肾脏表达丰度较低.Akt2则在小脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏和肌肉组织中高表达,而在大脑和肾脏中表达丰度较低.     

苏云金芽孢杆菌猝倒亚种Cry1Aa13基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中Cry1A类基因序列设计一对特异性引物，以苏云金芽孢杆茵猝倒亚种质粒DNA为模板，应用PCR扩增技术得到一大小约为3．6kb的DNA片段(Cry1Aa13)．通过引物步行法测定该片段长3598bp，其中开放阅读框(ORF)长3540bp，编码1180个氨基酸，分子量为133．49kD，等电点pI=5．0．序列比较表明该基因与Cry1Aa类基因高度同源(达95％以上)，该基因已在GenBank中登录，登录号为AF510713，并被Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为Cry1Aa13。     

巨大芽孢杆菌AP25内切葡聚糖酶基因的克隆及序列测定

从土壤中分离到一株产纤维素酶的巨大芽孢杆菌AP25,经羧甲基纤维素平板检测,该菌可产生葡聚糖内切酶。根据GenBank登录的β-1,4内切葡聚糖酶基因（DQ782954．1,M28332．1,AY859492．1）的同源性序列,利用PCR方法克隆到该酶的基因,并对其进行测序。测序结果显示其全长为1500bp,推测其含499个氨基酸。与GenBank中的已知葡聚糖内切酶相比较,发现该酶的氨基酸序列与Bacillus subtilis的β-1,4内切葡聚糖酶基因同源性达到达94％。     

At3g13600截短型蛋白的原核表达载体的构建

拟南芥基因At3g13600编码一种钙调素结合蛋白,序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 818 bp,编码一个具有606个氨基酸残基的多肽,推测分子量为68.9 kD;在At3g13600蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象.为了从实验上进一步研究该蛋白的钙调素结合特性,通过逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR)扩增含...     

生物信息学技术克隆并分析新基因STRF7

为进一步研究信号转导相关的新基因片段BE644250,采用生物信息学方法克隆基全长cDNA,并分析了其ORF,电子表达谱,染色体定位等,之后对全长序列进行了实验验证。电子延伸（contig)获得了729bp的延伸产物,含一个典型的74aa的ORF,命名为STRF7。与已知蛋白无明显同源性,部分地相似于人的源框蛋白CDX－4和酵母的转录调节子ADR6,属一新发现的基因;RT－PCR从IL－6刺激后的U937中克隆了STRF7基因,基序列与电子延伸结果安全一致,进一步的分析显示STRF7在多种组织中表达并定位于第6号染色体上,上述结果显示,STRF7是一个新基因,编码含74aa的蛋白,并且是一个潜在的转录因子。     

Molecular cloning, in vitro expression and enzyme activity analysis of violaxan-thin de-epoxidase from Oryza sativa L.

The violaxanthin de-epoxidase gene was cloned from rice (Oryza sativa subsp. japonica). The full length of the cDNA is 1887 bp, encoding a 446-amino acids protein with the transit peptide of 98 amino acids. The bacterial expression vector pET-Rvde was constructed and the expression quantity of the exogenous protein increased with the induction time by 0.4 mmol/L IPTG. Its molecular weight was similar with that of the native VDE. Western blotting indicated that the expressed protein has immunological reaction with the VDE polyclonal antibody. The absorbance spectrum together with xanthophyll pigments quantification by HPLC demonstrated that the expressed VDE has its enzyme activity, which can de-epoxidate violaxanthin into antheraxanthin and zeaxanthin in vitro.